逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的端粒酶抑制基因?qū)Ω伟┰鲋车蛲龅淖饔?pdf

1、目的：以逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，將端粒酶抑制基因?qū)敫伟┘?xì)胞，研究其對(duì)肝癌體內(nèi)外生長(zhǎng)的抑制作用，為肝癌的基因治療提供新途徑。 方法：使用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體pLXSN構(gòu)建的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pLXSN-hTR，攜帶反義端粒酶RNA基因，將其用電穿孔的方法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PT67細(xì)胞，G418篩選抗性細(xì)胞，獲取陽(yáng)性細(xì)胞克隆株，即穩(wěn)定表達(dá)病毒的產(chǎn)病毒細(xì)胞株，收集細(xì)胞上清液，濃縮得到重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，用NIH3T3細(xì)胞測(cè)定病毒滴度。將濃縮后的病毒直

2、接感染人肝癌細(xì)胞株Bel-7402，PCR檢測(cè)目的基因的插入，端粒酶反義RNA組分整合入肝癌細(xì)胞基因組中，通過(guò)其在細(xì)胞內(nèi)與hTR結(jié)合而抑制肝癌細(xì)胞端粒酶活性，從而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)、MTT法與流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和凋亡情況。 采用Bel-7402細(xì)胞株建立裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型。待腫瘤長(zhǎng)至約5mm時(shí)采用隨機(jī)數(shù)字法將裸鼠分為A、B、C、D、E、F 6組，分別給每組裸鼠腹腔注射5-

3、Fu、生理鹽水、5-Fu、5-Fu、生理鹽水、生理鹽水，同時(shí)分別局部注射質(zhì)粒BamHl、質(zhì)粒BamHl、生理鹽水、質(zhì)粒EcoRl、質(zhì)粒EcoRl、生理鹽水。隔日注藥一次，共三次。測(cè)量腫瘤體積，繪制各組腫瘤的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，計(jì)算抑瘤率。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，對(duì)移植瘤組織進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察瘤組織的形態(tài)學(xué)改變，TUNEL法檢測(cè)瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù)。 結(jié)果： 反義端粒酶RNA基因和5-Fu均能抑制Bel-7402的體外、體內(nèi)

4、生長(zhǎng)，兩者聯(lián)合應(yīng)用能明顯增加療效。從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，MTT均可以看出A組抑制最明顯。 反義端粒酶RNA基因和5-Fu能不同程度引起B(yǎng)el-7402細(xì)胞的體內(nèi)、體外凋亡壞死。流式細(xì)胞顯示A組(71.71±2.53)％，B組(61.32±2.24)％，C組(36.82±2.42)％，D組 (36.46±1.71)％，E組(23.02±2.13)％。F組(4.11±1.00)％。除C、D兩組外其余各組比較p

5、有顯著性差異。各組腫瘤組織HE染色后均有不同程度的壞死，其中，對(duì)照組多以輕中度壞死為主，用藥后壞死面積均增加，A組可見(jiàn)大片壞死組織，瘤細(xì)胞只占切片的小部分。TUNEL法顯示各組凋亡指數(shù)分別為A組(35.2±11.4)％，B組(19.18±8.22)％，C組(16.18±10.65)％，D組(17.14±9.54)％，E組(5.6±3.21)％，F(xiàn)組(5.28±3.21)％。除BC組、BD組、CD組、EF組外，余各組之間兩兩比較p<0.0