逆轉錄病毒載體介導聯(lián)合雙基因CD：：UPRT-5-FC對膠質瘤治療作用的實驗研究.pdf

1、全文分為六部分： 第一部分 含CD：：UPRT融合基因的逆轉錄病毒表達載體的構建與病毒包裝 目的：建立含CD：：UPRT融合基因的重組逆轉錄病毒表達載體，包裝含目的基因的重組逆轉錄病毒。 方法：根據逆轉錄病毒表達載體pLXSN的多克隆位點及 pORF5-CD：：UPRT質粒上CD：：UPRT的基因序列，設計PCR引物，在引物的5’端分別引入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點，采用常規(guī)PCR從pORF5-CD：：U

2、PRT中擴增出CD：：UPRT融合基因，經核酸序列測定正確后，分別克隆進入pLXSN和LZRSpBMN-Z。經雙酶切鑒定無誤后，轉染包裝細胞PT67和Pheonix，擴大培養(yǎng)陽性克隆，收集上清，獲得重組逆轉錄病毒。 結論：成功構建逆轉錄病毒表達載體LZRS-CD：：UPRT和 pLXSN-CD：：UPRT，收獲含CD：：UPRT基因的重組逆轉錄病毒。 第二部分穩(wěn)定表達CD：：UPRT的C6細胞株的建立與鑒定 目的

3、：建立能穩(wěn)定表達CD：：UPRT的C<,6>修飾細胞株，為CD：：UPRT聯(lián)合基因治療建立研究平臺。 方法：以含重組質粒pLXSN-CD：：UPRT和空質粒pLXSN的重組逆轉錄病毒分別轉染C6細胞，(加入終濃度為8μg/ml的聚凝胺輔助病毒轉染)，設立無病毒轉染的C6細胞對照組，轉染時32℃ 1000g離心30分鐘以提高病毒轉染率。轉染6小時后更換新鮮培養(yǎng)液，24小時重復轉染一次，末次轉染后48小時加入終濃度為200μg/ml

4、的G418，篩選14天。篩選14天后對抗性細胞克隆進行擴大培養(yǎng)(培養(yǎng)液10％FCS RPMl1640)，所獲抗性細胞分別命名為C6-CD：：UPRT和C6-pLXSN，電泳驗證各細胞導入基因，并比較C6-CD：：UPRT和原C6的生物學特性。 結論：成功地通過重組逆轉錄病毒的介導將目的基因CD：：UPRT轉導至大鼠膠質瘤細胞株C6中，經傳代培養(yǎng)鑒定證明目的基因獲得穩(wěn)定有效表達，C6-CD：：UPRT細胞株傳代等生物學特性與原代細

5、胞c6無差異。 第三部分 CD：：UPRT/5-FC基因治療方案對膠質瘤細胞C6的殺傷作用及殺傷機理的研究 目的：觀察CD：：UPRT/5-FC基因治療方案對修飾C6膠質瘤細胞的殺傷作用，并且探討可能的殺傷機理。 方法：設C6-CD：：UPRT為實驗組，C6、C6-pLXSN細胞為對照組，細胞培養(yǎng)過程中加入5-FC(終濃度分別為0、0.1、1、10、100、 1000gmol/L)，用MTT法測定5-FC對各組腫

6、瘤細胞殺傷效應并計算細胞生長抑制率，免疫組化檢測凋亡相關蛋白Fas、Fas-L及Bcl-2的表達、流式細胞儀檢測細胞凋亡比例及電鏡觀察等方面來研究腫瘤細胞殺傷情況。 結論：CD：：UPRT/5-FC系統(tǒng)在體外對膠質瘤細胞有明顯的抑制和殺傷作用，其殺傷膠質瘤細胞的機制可能與凋亡有關，而且可能與Fas、 Fas-L及Bcl-2誘導的凋亡有關。 第四部分 5-FC對裸鼠接種C6-CD：：UPRT腫瘤的治療作用 目的：觀

7、察CD：：UPRT/5-FC基因治療系統(tǒng)對裸鼠皮下膠質瘤的治療效果。 方法：裸鼠皮下種植C6-CD：：UPRT、C6-PLXSN及C6細胞7天后腹腔注射5-FC或PBS液，比較裸鼠生存期及腫瘤大小，用流式細胞儀檢測細胞凋亡比例，電鏡觀察細胞形態(tài)變化。 結論：CD：：UPRT/5-FC基因治療方案對裸鼠皮下膠質瘤有明顯的殺傷和抑制作用，CD：：UPRT/5-FC對膠質瘤的殺傷作用有凋亡機制的參與。 第五部分 CD：

8、：UPRT/5-FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)對大鼠腦膠質瘤治療作用的實驗研究 目的：以大鼠顱內腦膠質瘤模型為基礎，觀察CD：：UPRT/5-FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)對大鼠腦膠質瘤細胞的殺傷作用，以正確評價 CD：：UPRT/5-FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)對顱內腦膠質瘤的治療作用。 方法：應用立體定向技術種植C6-CD：：UPRT細胞至SD大鼠尾狀核，建立顱內膠質瘤荷瘤鼠模型，設立C6-pLXSN和C6細胞為對照組，應用5-FC腹腔注射治療

9、，觀察腫瘤大小、大鼠生存期、電鏡觀察細胞形態(tài)和流式細胞儀檢測腫瘤細胞的凋亡指標的變化。 結論：CD：：IYPRT/5-FC聯(lián)合基因治療對大鼠顱內腦膠質瘤有明顯的抑制和殺傷作用，其機理與促進細胞凋亡有關。 第六部分 CD：：UPRT/5-FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)藥代動力學及旁觀者效應和作用機理的研究 目的：在體外和體內水平直接觀察C6-CD：：UPRT細胞內CD：：LYPRT雙基因表達產物對5-FC作用的藥代動力學，并

10、研究CD：：UPRT/5-FC基因治療系統(tǒng)的旁觀者效應和相關機理。建立一種無創(chuàng)、動態(tài)、定量的基因治療觀測系統(tǒng)。 方法：C6和C6-CD：：UPRT細胞株均用含10％FCS小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞附壁后更換培養(yǎng)液，同時加入終濃度為 1000μmol/L 5-FC繼續(xù)培養(yǎng)24后終止培養(yǎng)，用核磁共振質譜法(MRS)測定<'19>F的磁共振磁譜(<'19+>F-MRS)變化，分別檢測細胞培養(yǎng)混合成分、細胞和細胞外培

11、養(yǎng)液中氟化物含量。 使用<'19>FMRS質子掃描對荷瘤鼠顱內腫瘤進行體內5-FC藥代動力學的測定。 將C6-CD：：UPRT及未轉染基因的C6細胞按照不同比例混和，C6-CD：：UPRT細胞所占比例分別為：0％、10％、25％、50％、75％、100％。用含終濃度為1000gmol/L 5-FC的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)4天，MTT法檢測OD值計算細胞生長抑制率，進一步計算細胞生存率，繪制細胞生存曲線，進行旁觀者效

12、應的觀察。將C6-CD：：UPRT及未轉染基因的C6細胞按照25％、75％混合細胞接種3×10<'6>細胞于25ml培養(yǎng)瓶，至對數生長期更換培養(yǎng)液，加入終濃度為1000μmol/L 5-FC培養(yǎng)24小時后收集細胞培養(yǎng)液進行<'19>F MRS檢測。 結論： C6-CD：：UPRT能夠有效表達CD、UPRT酶，高效催化5-FC轉化為5-FU再進一步代謝為F-Nuctd，直接發(fā)揮殺傷膠質瘤細胞的作用。CD：：UPRT/5-F