逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)聯(lián)合雙基因CD：：UPRT-5-FC對膠質(zhì)瘤治療作用的實驗研究.pdf

1、全文分為六部分： 第一部分 含CD：：UPRT融合基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的構(gòu)建與病毒包裝 目的：建立含CD：：UPRT融合基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體，包裝含目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。 方法：根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLXSN的多克隆位點及 pORF5-CD：：UPRT質(zhì)粒上CD：：UPRT的基因序列，設(shè)計PCR引物，在引物的5’端分別引入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點，采用常規(guī)PCR從pORF5-CD：：U

2、PRT中擴增出CD：：UPRT融合基因，經(jīng)核酸序列測定正確后，分別克隆進入pLXSN和LZRSpBMN-Z。經(jīng)雙酶切鑒定無誤后，轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PT67和Pheonix，擴大培養(yǎng)陽性克隆，收集上清，獲得重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。 結(jié)論：成功構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體LZRS-CD：：UPRT和 pLXSN-CD：：UPRT，收獲含CD：：UPRT基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。 第二部分穩(wěn)定表達CD：：UPRT的C6細(xì)胞株的建立與鑒定 目的

3、：建立能穩(wěn)定表達CD：：UPRT的C<,6>修飾細(xì)胞株，為CD：：UPRT聯(lián)合基因治療建立研究平臺。 方法：以含重組質(zhì)粒pLXSN-CD：：UPRT和空質(zhì)粒pLXSN的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒分別轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞，(加入終濃度為8μg/ml的聚凝胺輔助病毒轉(zhuǎn)染)，設(shè)立無病毒轉(zhuǎn)染的C6細(xì)胞對照組，轉(zhuǎn)染時32℃ 1000g離心30分鐘以提高病毒轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染6小時后更換新鮮培養(yǎng)液，24小時重復(fù)轉(zhuǎn)染一次，末次轉(zhuǎn)染后48小時加入終濃度為200μg/ml

4、的G418，篩選14天。篩選14天后對抗性細(xì)胞克隆進行擴大培養(yǎng)(培養(yǎng)液10％FCS RPMl1640)，所獲抗性細(xì)胞分別命名為C6-CD：：UPRT和C6-pLXSN，電泳驗證各細(xì)胞導(dǎo)入基因，并比較C6-CD：：UPRT和原C6的生物學(xué)特性。 結(jié)論：成功地通過重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的介導(dǎo)將目的基因CD：：UPRT轉(zhuǎn)導(dǎo)至大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株C6中，經(jīng)傳代培養(yǎng)鑒定證明目的基因獲得穩(wěn)定有效表達，C6-CD：：UPRT細(xì)胞株傳代等生物學(xué)特性與原代細(xì)

5、胞c6無差異。 第三部分 CD：：UPRT/5-FC基因治療方案對膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的殺傷作用及殺傷機理的研究 目的：觀察CD：：UPRT/5-FC基因治療方案對修飾C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用，并且探討可能的殺傷機理。 方法：設(shè)C6-CD：：UPRT為實驗組，C6、C6-pLXSN細(xì)胞為對照組，細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入5-FC(終濃度分別為0、0.1、1、10、100、 1000gmol/L)，用MTT法測定5-FC對各組腫

6、瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)并計算細(xì)胞生長抑制率，免疫組化檢測凋亡相關(guān)蛋白Fas、Fas-L及Bcl-2的表達、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡比例及電鏡觀察等方面來研究腫瘤細(xì)胞殺傷情況。 結(jié)論：CD：：UPRT/5-FC系統(tǒng)在體外對膠質(zhì)瘤細(xì)胞有明顯的抑制和殺傷作用，其殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的機制可能與凋亡有關(guān)，而且可能與Fas、 Fas-L及Bcl-2誘導(dǎo)的凋亡有關(guān)。 第四部分 5-FC對裸鼠接種C6-CD：：UPRT腫瘤的治療作用 目的：觀

7、察CD：：UPRT/5-FC基因治療系統(tǒng)對裸鼠皮下膠質(zhì)瘤的治療效果。 方法：裸鼠皮下種植C6-CD：：UPRT、C6-PLXSN及C6細(xì)胞7天后腹腔注射5-FC或PBS液，比較裸鼠生存期及腫瘤大小，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡比例，電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 結(jié)論：CD：：UPRT/5-FC基因治療方案對裸鼠皮下膠質(zhì)瘤有明顯的殺傷和抑制作用，CD：：UPRT/5-FC對膠質(zhì)瘤的殺傷作用有凋亡機制的參與。 第五部分 CD：

8、：UPRT/5-FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)對大鼠腦膠質(zhì)瘤治療作用的實驗研究 目的：以大鼠顱內(nèi)腦膠質(zhì)瘤模型為基礎(chǔ)，觀察CD：：UPRT/5-FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)對大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用，以正確評價 CD：：UPRT/5-FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)對顱內(nèi)腦膠質(zhì)瘤的治療作用。 方法：應(yīng)用立體定向技術(shù)種植C6-CD：：UPRT細(xì)胞至SD大鼠尾狀核，建立顱內(nèi)膠質(zhì)瘤荷瘤鼠模型，設(shè)立C6-pLXSN和C6細(xì)胞為對照組，應(yīng)用5-FC腹腔注射治療

9、，觀察腫瘤大小、大鼠生存期、電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡指標(biāo)的變化。 結(jié)論：CD：：IYPRT/5-FC聯(lián)合基因治療對大鼠顱內(nèi)腦膠質(zhì)瘤有明顯的抑制和殺傷作用，其機理與促進細(xì)胞凋亡有關(guān)。 第六部分 CD：：UPRT/5-FC聯(lián)合基因治療系統(tǒng)藥代動力學(xué)及旁觀者效應(yīng)和作用機理的研究 目的：在體外和體內(nèi)水平直接觀察C6-CD：：UPRT細(xì)胞內(nèi)CD：：LYPRT雙基因表達產(chǎn)物對5-FC作用的藥代動力學(xué)，并

10、研究CD：：UPRT/5-FC基因治療系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng)和相關(guān)機理。建立一種無創(chuàng)、動態(tài)、定量的基因治療觀測系統(tǒng)。 方法：C6和C6-CD：：UPRT細(xì)胞株均用含10％FCS小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞附壁后更換培養(yǎng)液，同時加入終濃度為 1000μmol/L 5-FC繼續(xù)培養(yǎng)24后終止培養(yǎng)，用核磁共振質(zhì)譜法(MRS)測定<'19>F的磁共振磁譜(<'19+>F-MRS)變化，分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)混合成分、細(xì)胞和細(xì)胞外培

11、養(yǎng)液中氟化物含量。 使用<'19>FMRS質(zhì)子掃描對荷瘤鼠顱內(nèi)腫瘤進行體內(nèi)5-FC藥代動力學(xué)的測定。 將C6-CD：：UPRT及未轉(zhuǎn)染基因的C6細(xì)胞按照不同比例混和，C6-CD：：UPRT細(xì)胞所占比例分別為：0％、10％、25％、50％、75％、100％。用含終濃度為1000gmol/L 5-FC的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)4天，MTT法檢測OD值計算細(xì)胞生長抑制率，進一步計算細(xì)胞生存率，繪制細(xì)胞生存曲線，進行旁觀者效

12、應(yīng)的觀察。將C6-CD：：UPRT及未轉(zhuǎn)染基因的C6細(xì)胞按照25％、75％混合細(xì)胞接種3×10<'6>細(xì)胞于25ml培養(yǎng)瓶，至對數(shù)生長期更換培養(yǎng)液，加入終濃度為1000μmol/L 5-FC培養(yǎng)24小時后收集細(xì)胞培養(yǎng)液進行<'19>F MRS檢測。 結(jié)論： C6-CD：：UPRT能夠有效表達CD、UPRT酶，高效催化5-FC轉(zhuǎn)化為5-FU再進一步代謝為F-Nuctd，直接發(fā)揮殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用。CD：：UPRT/5-F