逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的IL-1Ra和TGF-β1聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎的研究.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，多發(fā)于老年人群，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量，且需消耗大量的個(gè)人及社會(huì)財(cái)力。國(guó)內(nèi)的統(tǒng)計(jì)資料表明，我國(guó)患有OA的人數(shù)占總?cè)丝诘?％，其中大部分為膝OA，55歲以上人群X線有膝OA表現(xiàn)者約60％，65歲以上老年人OA的發(fā)病率可達(dá)85％，75歲以上的老年人中每人都有至少一個(gè)關(guān)節(jié)有OA變化。目前，傳統(tǒng)的藥物治療和外科手段對(duì)OA的療效有限，且無(wú)法阻止OA的進(jìn)一步發(fā)展，近年來(lái)基因治療為

2、OA的防治開(kāi)辟了一條新途徑，受到越來(lái)越多的重視。將功能基因片段整合到基因載體內(nèi)，再將基因載體轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞中或轉(zhuǎn)染入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的靶細(xì)胞持續(xù)大量分泌功能基因產(chǎn)物，在一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)期保持局部治療濃度，由于OA病變主要累及少數(shù)負(fù)重關(guān)節(jié)，因此適合應(yīng)用關(guān)節(jié)內(nèi)局部基因治療。在臨床應(yīng)用基因治療OA之前，我們有必要在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中確證哪些基因或基因的組合會(huì)對(duì)OA產(chǎn)生更好的治療效果，目前已有許多研究以表明基因療法對(duì)OA的有效性，并且多基因聯(lián)合

3、治療OA效果好于單基因，在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用重組人IL-1Ra(一種很重要的拮抗基因)和TGF—β1(一種很重要的保護(hù)基因)基因從促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成和抑制軟骨基質(zhì)降解兩個(gè)層面聯(lián)合轉(zhuǎn)染治療OA。 第一部分聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染兔膝軟骨細(xì)胞及對(duì)其增值代謝的影響 目的:觀察以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，介導(dǎo)白介素-1受體拮抗蛋白(IL-1Ra)基因與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β1(TGF—β1)基因共轉(zhuǎn)染兔膝軟骨細(xì)胞后的表達(dá)，及對(duì)其增殖代謝的影響。 方

4、法:將體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞分為空白轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、IL-1Ra單基因轉(zhuǎn)染組、TGF—β1單基因轉(zhuǎn)染組及IL-1Ra和TGF—β1雙基因轉(zhuǎn)染組。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)進(jìn)行瞬時(shí)基因表達(dá)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h)及穩(wěn)定基因表達(dá)(篩選第4w)的檢測(cè)；免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組IL-1Ra、TGF—β1及Ⅱ型膠原的表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)周期比例。 結(jié)果:空白組與PLNCX2空載體轉(zhuǎn)染組的上述指標(biāo)差異無(wú)顯著性(P＞0.05

5、)；ELISA檢測(cè)顯示基因轉(zhuǎn)染組有明顯基因表達(dá)；與空白組及PLNCX2空載體轉(zhuǎn)染組相比，雙基因轉(zhuǎn)染組IL-1Ra、TGF—β1、Ⅱ型膠原含量明顯提高(P＜0.05)，IL-1Ra單基因轉(zhuǎn)染組IL-1Ra含量提高明顯，TGF—β1單基因轉(zhuǎn)染組TGF—β1、Ⅱ型膠原含量提高明顯；基因轉(zhuǎn)染組軟骨細(xì)胞位于S期的比例增高明顯，與空白組比較差異有顯著性(P＜0.05)。 結(jié)論:基因轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后可獲得穩(wěn)定表達(dá)，IL-1Ra+TGF—β1雙基

6、因轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞生物學(xué)活性優(yōu)于兩者中的任一單基因轉(zhuǎn)染，為基因治療骨關(guān)節(jié)炎的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二部分聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎的研究 目的:觀察白細(xì)胞介素-1受體拮抗蛋白(IL-1Ra)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β1(TGF—β1)雙基因轉(zhuǎn)染在關(guān)節(jié)中的表達(dá)及對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療效果。 方法:以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，體外轉(zhuǎn)染同種異體原代軟骨細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染了外源基因的軟骨細(xì)胞注射入兔膝關(guān)節(jié)腔。前交叉韌帶切斷法(ACLT)制成新西蘭白

7、兔膝關(guān)節(jié)OA模型，共30只，隨機(jī)分為5組，Ⅰ組為空白對(duì)照組，Ⅱ組為手術(shù)對(duì)照組，Ⅲ組為IL-1Ra轉(zhuǎn)染組，Ⅳ組為T(mén)GF—β1轉(zhuǎn)染組，Ⅴ組為IL-1Ra和TGF—β1雙基因轉(zhuǎn)染組。外源基因注射后第4周與第8周，用PBS灌洗兔膝關(guān)節(jié)，ELISA分析轉(zhuǎn)基因表達(dá)，硝酸還原法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)液中NO含量，取關(guān)節(jié)標(biāo)本進(jìn)行Mankin’s評(píng)分，阿爾辛藍(lán)—過(guò)碘酸雪夫試劑(AB—PAS)染色，TGF—β1、IL-1Ra及Ⅱ型膠原免疫組化、原位雜交檢測(cè)。

8、結(jié)果：ELISA檢測(cè)顯示在第4周基因轉(zhuǎn)染組有明顯的基因表達(dá)，第8周基因表達(dá)減弱；手術(shù)對(duì)照組軟骨損傷程度最大，Mankin’s評(píng)分明顯高于其他組；TGF—β1、IL-1Ra及Ⅱ型膠原免疫組化染色，手術(shù)對(duì)照組灰度值低于其他組，單基因轉(zhuǎn)染組灰度值低于雙基因轉(zhuǎn)染組，8周時(shí)各對(duì)應(yīng)組灰度值較4周有明顯下降。 結(jié)論:以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體將轉(zhuǎn)染了外源基因的軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)入骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)內(nèi)，可獲得穩(wěn)定的外源基因表達(dá)，TGF—β1和IL-1Ra可有效阻止O