IL-1Ra和IL-10聯(lián)合基因治療在骨關(guān)節(jié)炎中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、目的：前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已初步證實(shí)：IL-1Ra和IL-10聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染的同種異體滑膜細(xì)胞行關(guān)節(jié)腔注射后，可定位于滑膜襯里，并有穩(wěn)定的外源基因表達(dá)，且治療效果明顯優(yōu)于單獨(dú)導(dǎo)入其中任何一種基因。但并不知道，聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染對(duì)于更具有臨床意義的人膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，是否也獲得良好的生物學(xué)作用，能否有效轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)于細(xì)胞增殖有何影響，同時(shí)不同基因轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞中是否存在差異表達(dá)的基因？在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究中我們通過(guò)構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體P

2、LXRN-IL-1Ra、PLXRN-IL-10，體外IL-1Ra和IL-10聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染OA患者滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，多個(gè)水平檢測(cè)目的基因表達(dá)及觀察基因轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的作用，探討IL-1Ra和IL-10基因在人OA治療中的可行性和作用。同時(shí)以反義DNA（cDNA）陣列技術(shù)對(duì)OA軟骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜特征進(jìn)行研究，比較不同目的基因轉(zhuǎn)染后OA軟骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜，尋找基因治療前后軟骨細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，進(jìn)一步探討聯(lián)合基因治療OA的分子機(jī)制，

3、從而為OA發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步闡明提供依據(jù)。 方法： 1. 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLXRN-IL-1Ra、PLXRN-IL-10的構(gòu)建和鑒定，病毒包裝和滴度的測(cè)定：構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒PcDNA3.1-IL-1Ra和PcDNA3.1-IL-10；真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、篩選、擴(kuò)增后進(jìn)行基因測(cè)序并與Genbank中的相應(yīng)序列比對(duì)；構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLXRN-IL-1Ra、PLXRN-IL-10；限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定；細(xì)胞株P(guān)T67和 NIH

4、/3T3的體外培養(yǎng)及G418最佳的篩選濃度的確定；PT67細(xì)胞包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLXRN、PLXRN-IL-1Ra和PLXRN-IL-10；G418篩選產(chǎn)病毒細(xì)胞株獲得陽(yáng)性克隆,擴(kuò)增后收集病毒原液；使用NIH/3T3測(cè)定PLXRN、PLXRN-IL-1Ra和PLXRN-IL-10病毒滴度。 2.IL-1Ra和IL-10聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染在OA患者滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞中的表達(dá)及生物學(xué)作用：原代滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)共分5組，分

5、別為未轉(zhuǎn)染組（A組）、PLXRN空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（B組）、PLXRN-IL-1Ra轉(zhuǎn)染組（C組）、PLXRN-IL-10轉(zhuǎn)染組（D組）和PLXRN-IL-1Ra+PLXRN-IL-10聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染組（E組）。PLXRN、PLXRN-IL-1Ra和PLXRN-IL-10病毒單獨(dú)或聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染OA患者第3代滑膜細(xì)胞和原代軟骨細(xì)胞；滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的G418最小致死劑量的測(cè)定；MTT檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染對(duì)滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞增殖的影響；RT-PCR檢測(cè)h

6、IL-1Ra和hIL-10基因在滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞中的表達(dá)；ELISA檢測(cè)滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞體外hIL-1Ra和hIL-10蛋白的表達(dá)。 3.不同目的基因轉(zhuǎn)染OA患者軟骨細(xì)胞前后差異表達(dá)基因的篩選：PLXRN、PLXRN-IL-1Ra和PLXRN-IL-10病毒轉(zhuǎn)染OA患者原代軟骨細(xì)胞；各組總RNA提取、純化及質(zhì)檢；探針的合成、標(biāo)記與純化；cDNA陣列膜的雜交；圖像的掃描和數(shù)據(jù)分析；差異表達(dá)基因的篩選。 結(jié)果：

7、1.質(zhì)粒PcDNA3.1-IL-1Ra和PcDNA3.1-IL-10轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增后進(jìn)行基因測(cè)序并與Genbank中的相應(yīng)序列比對(duì)無(wú)誤；PLXRN-IL-1Ra經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶EcoR-I切割后可釋放出約900bp大小的hIL-1Ra片段，PLXRN-IL-10經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Sal-I和Xho-I切割后可釋放出約1100bp大小的hIL-10片段,說(shuō)明載體構(gòu)建成功；PT67細(xì)胞包裝PLXRN、PLXRN-IL-1Ra和PLXRN-IL-10逆

8、轉(zhuǎn)錄病毒，NIH/3T3細(xì)胞測(cè)定病毒滴度分別為3.5×105、3×104 ,5×104 CFU/ml。 2.基因轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞后，MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：滑膜細(xì)胞中，病毒轉(zhuǎn)染可抑制滑膜細(xì)胞的增殖，聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染時(shí)抑制作用更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；軟骨細(xì)胞中，PLXRN-IL-1Ra基因轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染后72h時(shí)間點(diǎn)對(duì)軟骨細(xì)胞增殖有抑制作用，而PLXRN-IL-10和PLXRN基因轉(zhuǎn)染組分別在72h和96h時(shí)間點(diǎn)有促進(jìn)軟

9、骨細(xì)胞增殖的作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。除此以外，病毒轉(zhuǎn)染對(duì)軟骨細(xì)胞增殖基本無(wú)影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。RT-PCR檢測(cè)在第C、E組出現(xiàn)311 bp大小的IL-1Ra的mRNA片段，第D、E組有328 bp大小的IL-10的mRNA片段的表達(dá)。而A組和B組未見(jiàn)IL-1Ra和IL-10 mRNA的表達(dá)帶，GAPDH在各組均有表達(dá)。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染組均有相應(yīng)的一定量的hIL-1Ra和hIL-10表達(dá)?；?/p>

10、細(xì)胞中單個(gè)基因轉(zhuǎn)染組（C組和D組）中蛋白hIL-1Ra和hIL-10濃度分別為：（51.43±13.13）ng/l和(5.11±3.62）ng/l；聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染組（E組）中分別為（46.37±5.85）ng/l和(6.35±3.02）ng/l；軟骨細(xì)胞中單個(gè)基因轉(zhuǎn)染組（C組和D組）中蛋白hIL-1Ra和hIL-10濃度分別為(60.47±15.13）ng/l和(19.73±4.10）ng/l；聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染組（E組）為（67.15±11.

11、47）ng/l和(16.76±9.96）ng/l。A組及B組均無(wú)hIL-1Ra和hIL-10表達(dá)，單個(gè)或聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染組（C、D、E組）與對(duì)照組（A、B組）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而單個(gè)基因轉(zhuǎn)染組（C、D組）和聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染組（E組）組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 3.基因芯片檢測(cè)不同目的基因的單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染前后的基因表達(dá)譜，篩選軟骨細(xì)胞中差異表達(dá)基因。以對(duì)照組PLXRN有效基因?yàn)閰⒄?，?shí)驗(yàn)組PLXRN-IL-

12、1Ra、PLXRN-IL-10、DT分別表達(dá)7個(gè)、17個(gè)和22個(gè)差異基因；以實(shí)驗(yàn)組（PLXRN-IL-1Ra）有效基因?yàn)閰⒄?，?shí)驗(yàn)組(DT)表達(dá)8個(gè)差異基因；以實(shí)驗(yàn)組（PLXRN-IL-10）有效基因?yàn)閰⒄?，?shí)驗(yàn)組(DT)表達(dá)14個(gè)差異基因。 結(jié)論： 1.利用新型復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（PLXRN）成功構(gòu)建了含人IL-1Ra和IL-10的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)PLXRN-IL-1Ra、PLXRN-IL-10。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染P

13、T67細(xì)胞后，該細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的外殼蛋白、核心蛋白與逆轉(zhuǎn)錄酶的組裝，能產(chǎn)生具有感染靶細(xì)胞能力并能介導(dǎo)IL-1Ra和IL-10基因轉(zhuǎn)移的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。 2.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLXRN介導(dǎo)的hIL-1Ra和hIL-10聯(lián)合基因可有效地感染人OA膝關(guān)節(jié)第3代滑膜細(xì)胞和原代軟骨細(xì)胞并獲得穩(wěn)定表達(dá)。單獨(dú)基因轉(zhuǎn)染和聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染其目的基因表達(dá)水平之間無(wú)顯著差異。所有病毒轉(zhuǎn)染組都有抑制滑膜細(xì)胞增殖的作用，聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染時(shí)抑制作用更明顯。然而絕大多數(shù)病