逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)人白介素-2基因轉(zhuǎn)染肝干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)人白介素2基因轉(zhuǎn)染肝干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究姓名：鄭和鳴申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：外科學(xué)（普外科）指導(dǎo)教師：蔡秀軍20070501浙江人學(xué)博學(xué)位論文中文文摘?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。第一部分人白細(xì)胞介素2cDNA的克隆及原核載體的構(gòu)建及其表達(dá)目的：通過(guò)RTPCR從人體周?chē)o脈血中擴(kuò)增IL一2全長(zhǎng)編碼序列，并構(gòu)建重組原核表達(dá)載體PET一32a—IL一2，并在大腸桿菌BL21中表達(dá)。方法：分離健康人外周靜脈血單核巨噬細(xì)胞，通

2、過(guò)細(xì)胞總RNA的提取、盯一PCR從人體周?chē)o脈血中擴(kuò)增IL一2全長(zhǎng)編碼序列，并將其克隆至T載體中。測(cè)序，并利用DNAStar軟件對(duì)所測(cè)定的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行編輯、分析。將IL一2全長(zhǎng)編碼序列克隆至PET一32aIL一2原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)10％SDS—PAGE凝膠屯泳、考馬斯亮藍(lán)染色及Westenblot鑒定。結(jié)果：正確擴(kuò)增出人IL2全長(zhǎng)編碼序列，測(cè)序結(jié)果正確，并分析了人白介素一2的

3、蛋白結(jié)構(gòu)。正確構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒PET32aIL2，測(cè)序結(jié)果正確，并在大腸桿菌中高效表達(dá)。結(jié)論：擴(kuò)增出的人IL一2和文獻(xiàn)報(bào)道的cDNA序列一致，并構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒PET32a—IL一2。關(guān)鍵詞：人白介素一2，克隆，序列分析，原核表達(dá)載體，基因表達(dá)第二部分?jǐn)y帶人IL屯基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及其在PT67細(xì)胞中的包裝目的：構(gòu)建人白介素一2基岡的逆轉(zhuǎn)錄病毒體系Plpcx—E6FP、Plpcx—IL一2EGFP及Plpcx—IL一

4、2，并研究其在包裝細(xì)胞PT67中的表達(dá)。方法：采用DNA重組技術(shù)，將pEGFPNI質(zhì)粒用占coRl和NotI進(jìn)行雙酶切，獲得EGFPcDNA片段，與用同樣酶切的Plpcx載體在LigationMix連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體PlpexEGFP。酶切鑒定，測(cè)序證實(shí)。以P町一32aIL一2為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增IL2金長(zhǎng)編碼序列，刪和EcoRI_)嘆酶切后將該片段克隆至Plpcx—EGFP。構(gòu)建成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒