逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)白細(xì)胞介素27轉(zhuǎn)染人食管癌細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)及其機(jī)理研究.pdf

1、本研究主要目的是深入探討IL-27在人食管癌中的抗腫瘤作用及其機(jī)理,為食管癌的基因治療研究提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 第一部分表達(dá)重組IL-27基因的人食管癌細(xì)胞Eea109/IL-27的建立 目的:利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體將重組小鼠IL-27基因轉(zhuǎn)染人食管癌細(xì)胞(Eca109),建立能表達(dá)和分泌IL-27的腫瘤細(xì)胞(Eca109/IL-27),并檢測(cè)外源性IL-27基因轉(zhuǎn)染對(duì)Eea109細(xì)胞體外增殖及其生物學(xué)性狀的影響,為深入

2、研究IL-27在食管癌中的抗腫瘤作用奠定基礎(chǔ)。 方法:將攜帶IL-27基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(LXSN/IL-27),經(jīng)過(guò)ψ2和PA317包裝細(xì)胞兩次包裝,利用該逆轉(zhuǎn)錄病毒將IL-27基因?qū)肴耸彻馨〦ta109細(xì)胞,經(jīng)G418篩選后獲得表達(dá)IL-27的陽(yáng)性細(xì)胞克隆Eca109/IL-27.用RT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)；ELISA法檢測(cè)IL-27的分泌；免疫熒光染色后激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)IL-27蛋白的表達(dá)；MTT比色法檢測(cè)腫

3、瘤細(xì)胞的體外增殖；流式細(xì)胞儀分析Eca109/IL-27細(xì)胞表面HLA-A,B,C(MHCI類(lèi)分子)、HLA-DR(MHCII類(lèi)分子)和CD80、CD86的表達(dá)。 結(jié)果: 1.攜帶IL-27基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒滴度為4～6×105CFU/ml,其培養(yǎng)上清中IL-27的分泌量為157.24±5.9 pg/ml,可用于轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞。 2.建立了能分泌IL-27的人食管癌Eea109/IL-27細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR以

4、及激光共聚焦顯微鏡和ELISA證實(shí)在mRNA水平和蛋白水平IL-27均可穩(wěn)定表達(dá)(P<0.01),IL-27的分泌量為153.73±7.00pg/ml.表明外源IL-27基因已整合到Eca109/IL-27細(xì)胞的基因組中并高效表達(dá)。 3.Eca109/IL-27細(xì)胞的形態(tài)特征及增殖反應(yīng)與野生型Eca109細(xì)胞和Eta109/LXSN細(xì)胞均無(wú)明顯差別(P>0.05)。 4.Eta109/IL-27細(xì)胞的細(xì)胞表面分子HLA-

5、A,B,C、HLA-DR和CD80、CD86的表達(dá)水平與野生型Eta109細(xì)胞和Eta109/LXSN細(xì)胞無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論:成功建立表達(dá)IL-27基因的人食管癌細(xì)胞(Eca109/IL-27)；IL-27基因?qū)隕ca109細(xì)胞后,對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和增殖及細(xì)胞表面分子的表達(dá)均無(wú)顯著影響。 第二部分IL-27對(duì)免疫細(xì)胞功能影響的體外研究 目的:研究IL-27對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞和裸鼠脾淋巴細(xì)胞免疫功能

6、的影響。 方法:將Eca109/IL-27、Eca109/LXSN和Eta109細(xì)胞培養(yǎng)上清作用于人外周血淋巴細(xì)胞,用ELISA法檢測(cè)誘導(dǎo)IL-12p70、IFN-γ、TNF-α和IL-4的產(chǎn)生情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+T細(xì)胞的含量和細(xì)胞表面分子HLA-A,B,C、HLA-DR和CD80、CD86的表達(dá),乳酸脫氫酶(LDH)法檢測(cè)殺傷性T細(xì)胞(CTL)活性；將上述細(xì)胞培養(yǎng)上清作用于裸鼠脾細(xì)胞,ELISA法檢測(cè)IFN-

7、γ的產(chǎn)生,LDH法檢測(cè)殺傷活性。 結(jié)果: 1.IL-27對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞免疫功能的影響 Eca109/IL-27細(xì)胞培養(yǎng)上清可誘導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IFN-γ、TNF-α僅和IL-12p70等Th1類(lèi)細(xì)胞因子,與Eca109/LXSN和Ecal09細(xì)胞相比有非常顯著性差異(P<0.01),而Th2類(lèi)細(xì)胞因子IL-4的分泌水平三組間無(wú)明顯差異(P>0.05)；外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)Eca109/IL-27細(xì)胞

8、的培養(yǎng)上清誘導(dǎo)后CD4+、CD8+T細(xì)胞百分比顯著增高(P<0.01),CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)(P<0.01),細(xì)胞表面分子HLA-A,B,C、HLA-DR和CD80、CD86的表達(dá)水平提高(P<0.01)。 2.IL-27對(duì)裸鼠脾細(xì)胞免疫功能的影響 Eca109/IL-27細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)裸鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ為48.7±4.3pg/ml,高于Eca109/LXSN和Eca109組(分別為6.3±1.5

9、pg/ml和4.9±1.4 pg/ml)(P<0.01),對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)(P<0.01)。 結(jié)論:IL-27能夠增強(qiáng)淋巴細(xì)胞免疫功能和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。 第三部分 IL-27在裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)及作用機(jī)理研究 實(shí)驗(yàn)一 IL-27對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)及免疫調(diào)節(jié)作用研究 方法:將Eca109/IL-27、Eca109/LXSN和Eca109細(xì)胞分別皮下和腹腔接種于裸鼠體內(nèi),觀(guān)察成瘤性、腫瘤生

10、長(zhǎng)情況及荷瘤裸鼠生存期.免疫組化法檢測(cè)裸鼠移植瘤組織NK細(xì)胞浸潤(rùn)；ELISA法檢測(cè)脾細(xì)胞IFN-γ產(chǎn)生:LDH法檢測(cè)脾細(xì)胞的殺傷活性；RT-PCR檢測(cè)移植瘤組織中IL-27基因和其他細(xì)胞因子基因的表達(dá)。 結(jié)果: 1.接種Eca109/IL-27細(xì)胞與Eca109/LXSN和Eca109細(xì)胞后,裸鼠成瘤率均為100％.接種Eca109/IL-27細(xì)胞裸鼠腫瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于接種Eca109/LXSN和Eca109細(xì)胞組(P

11、<0.05),裸鼠生存期延長(zhǎng)(P<0.01)。 2.接種Eca109/IL-27細(xì)胞組腫瘤組織中有IL-27p28和IL-27EB13基因的表達(dá),而接種Eca109/LXSN和Eca109細(xì)胞組腫瘤組織中未檢測(cè)到IL-27p28和IL-27EBI3基因的表達(dá)。 3.接種Eca109/1L-27細(xì)胞組腫瘤組織中NK細(xì)胞浸潤(rùn)比率較接種Eca109/LXSN和Eca109細(xì)胞組顯著增高(P<0.01)。 4.接種Eca

12、109/IL-27細(xì)胞組裸鼠脾細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生增加(P<0.01)；IFN-γ的產(chǎn)生與用滅活的野生型Eca109細(xì)胞再次誘導(dǎo)與否無(wú)關(guān)(P>0.05)。 5.接種Eca109/IL-27細(xì)胞的裸鼠脾細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)(P<0.01)。 6.接種Eca109/IL-27細(xì)胞組T-bet、IL-12Rβ2、TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá)較接種Eca109/LXSN和Ecal09細(xì)胞組增高(P<

13、0.05)。 結(jié)論:轉(zhuǎn)染IL-27的Eca109細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)產(chǎn)生了明顯的抗腫瘤作用.IL-27促進(jìn)荷瘤鼠移植瘤組織間質(zhì)中NK細(xì)胞的浸潤(rùn)；提高了脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力和殺傷活性；IL-27可促進(jìn)荷瘤鼠移植瘤組織中細(xì)胞因子的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二IL-27誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用研究 方法:采用流式細(xì)胞儀分析體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞及體內(nèi)腫瘤組織的細(xì)胞凋亡率；TUNEL法檢測(cè)三組腫瘤組織細(xì)胞原位凋亡；電鏡觀(guān)察腫瘤組織細(xì)胞凋亡的超

14、微結(jié)構(gòu)變化；用RT-PCR和Westem-blot法檢測(cè)腫瘤組織凋亡相關(guān)基因Fas和Survivin的表達(dá)。 結(jié)果: 1.體外培養(yǎng)的Eca109/IL-27、Eca109/LXSN和Eca109細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著性差異(P>0.05)；然而,將這三種腫瘤細(xì)胞接種于裸鼠后觀(guān)察,接種Eca109/IL-27細(xì)胞組裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率較接種野生型Eca109細(xì)胞組和Eca109/LXSN細(xì)胞組顯著增高。 2.TUNEL法檢

15、測(cè)結(jié)果顯示,接種Eca109/IL-27細(xì)胞組腫瘤組織內(nèi)有灶性分布的凋亡細(xì)胞,細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒,接種Eca109/LXSN細(xì)胞組和Eca109細(xì)胞組腫瘤組織內(nèi)僅見(jiàn)極少數(shù)散在分布的凋亡細(xì)胞.接種Eca109/IL-27組細(xì)胞凋亡率明顯高于接種Eca109/LXSN細(xì)胞組和野生型Eca109細(xì)胞組。 3.電鏡觀(guān)察可見(jiàn),接種Eca109/IL-27細(xì)胞組腫瘤組織細(xì)胞呈典型的凋亡細(xì)胞形態(tài),而接種Eca109和Eca109/LXSN細(xì)

16、胞組腫瘤組織細(xì)胞呈典型的腫瘤細(xì)胞形態(tài),未發(fā)現(xiàn)凋亡征象。 4.RT-PCR結(jié)果顯示,接種Eca109/IL-27細(xì)胞組裸鼠腫瘤組織中FasmRNA表達(dá)水平顯著高于接種Eca109/LXSN細(xì)胞和野生型Eca109細(xì)胞組(P<0.01)；而Survivin mRNA在接種Eca109/IL-27細(xì)胞組裸鼠瘤組織中的表達(dá)水平則顯著低于接種Eca109/LXSN細(xì)胞和Ecal09細(xì)胞組(P<0.01),轉(zhuǎn)染IL-27組Survivin與

17、Fas的比值降低(P<0.01)。 5.Western-blot結(jié)果顯示,接種Eca109/IL-27細(xì)胞組裸鼠腫瘤組織中Fas蛋白表達(dá)水平明顯高于接種Eca109/LXSN細(xì)胞和野生型Ecal09細(xì)胞組(P<0.01)；而Survivin蛋白在接種Eca109HL-27細(xì)胞組裸鼠腫瘤組織中的表達(dá)水平則明顯低于接種Eca109/LXSN細(xì)胞和Eca109細(xì)胞組(P<0.01),轉(zhuǎn)染IL-27組Survivin與Fas比值降低(P