重組腺病毒介導(dǎo)的白細(xì)胞介素23基因轉(zhuǎn)染人肝癌hepG2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：肝癌是最常見的惡性腫瘤之一。手術(shù)、化療、放療效果均難令人滿意，嚴(yán)重威脅人們的生存健康，迫切需要探索新的治療方法。近幾年來(lái)免疫治療和基因治療為肝腫瘤的治療開辟了新的途徑。利用細(xì)胞因子相關(guān)的多種方法治療腫瘤逐漸成為熱點(diǎn)。白細(xì)胞介素12（IL-12）已被證明在小鼠中能抑制原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肝臟腫瘤，而作為IL-12同家族成員，新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素23（IL-23）對(duì)結(jié)腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、胰腺癌等都有較強(qiáng)的抑制作用，結(jié)果令人

2、鼓舞，且毒性較IL-12低，為臨床使用提供了更為安全的途徑。目前，IL-23對(duì)肝癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也取得了較為滿意的療效，但其在體外是否對(duì)肝癌細(xì)胞有直接毒性作用，以及是否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過研究重組腺病毒介導(dǎo)的IL-23對(duì)人肝癌hepG2細(xì)胞的影響，進(jìn)一步探索IL-23對(duì)人肝癌hepG2細(xì)胞的作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用IL-23治療肝癌提供理論基礎(chǔ)。 方法：傳代培養(yǎng)人肝癌hepG2細(xì)胞，用攜帶人IL-23和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因

3、（EGFP）的重組腺病毒（adv-EGFP-IL-23）分別以感染復(fù)數(shù)（MOI）10、50、100、200、500轉(zhuǎn)染hepG2細(xì)胞，并設(shè)未轉(zhuǎn)染hepG2細(xì)胞作對(duì)照，24小時(shí)后分別在熒光及倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀測(cè)轉(zhuǎn)染效率，確定最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）。然后以最佳MOIadv-EGFP-IL-23轉(zhuǎn)染hepG2細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)IL-23（p19和p40亞基）mRNA的表達(dá)情況．MTT（噻唑藍(lán)）比色法

4、測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)（0、24、48、72小時(shí)）對(duì)照組、adv-EGFP組、adv-EGFP-IL-23轉(zhuǎn)染組hepG2細(xì)胞增殖．PI（碘化丙碇）染色后流式細(xì)胞儀測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)（24、48小時(shí)）各組細(xì)胞凋亡率。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11．5軟件包進(jìn)行單因素方差分析，以P<0．05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果：adv-EGFP-IL-23可以高效的轉(zhuǎn)染hepG2細(xì)胞，當(dāng)MOI為100時(shí)，轉(zhuǎn)染效率為91．63±4．8

5、3%，與MOI10（29．71±3．48%）、50（58．17±6．27%）組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0．05，而與MOI200（92．8±4．76%）、500（94．43±3．57%）組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0．05。倒置顯微鏡下見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好。在adv-EGFP-IL-23轉(zhuǎn)染hepG2細(xì)胞，RT-PCR可檢測(cè)到IL-23（p19和p40）mRNA的表達(dá)。MTT法分別檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)（0、24、48、72小時(shí)）對(duì)照組、adv

6、-EGFP組、adv-EGFP-IL-23 轉(zhuǎn)染組hepG2細(xì)胞增殖，見三組細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng)曲線基本重合，未見明顯抑制，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0．05。流式細(xì)胞儀分析不同時(shí)間點(diǎn)（24、48小時(shí)）各組細(xì)胞凋亡率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0．05。 結(jié)論：攜帶IL-23基因的重組腺病毒可以高效轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)IL-23（p19和p40）mRNA。adv-EGFP-IL-23，adv-EGFP轉(zhuǎn)染組以