白細(xì)胞介素-10重組腺病毒載體的構(gòu)建、病毒的制備及表達(dá)產(chǎn)物活性分析.pdf

1、目的:該文利用現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,構(gòu)建mIL-10重組腺病毒載體,制備具有活性的重組腺病毒,并對(duì)表達(dá)的mIL-10的活性進(jìn)行分析檢測(cè).為研究IL-10分子生物學(xué)及藥理學(xué)活性奠定了良好的基礎(chǔ),并為細(xì)胞因子補(bǔ)充和添加療法治療哮喘和基因治療哮喘等臨床研究做好了前期準(zhǔn)備.方法:從刺激后的小鼠脾細(xì)胞中克隆出mIL-10片段,利用pShuttle載體將mIL-10片段連入腺病毒載體,并用PCR反應(yīng)和酶切反應(yīng)對(duì)構(gòu)建的重組腺病毒載體進(jìn)行鑒定.分別從

2、磷酸鈣轉(zhuǎn)染的pH值、DNA純度、轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時(shí)間和甘油休克時(shí)間等方面優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,根據(jù)最優(yōu)條件,將mIL-10重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染入HEK 293T細(xì)胞,制備mIL-10重組腺病毒.分別用PCR反應(yīng)驗(yàn)證病毒的制備和終點(diǎn)稀釋檢測(cè)法測(cè)定病毒的滴度.對(duì)mIL-10的表達(dá)量和活性,采用ELISA法進(jìn)行定量和檢測(cè).結(jié)論:該文成功構(gòu)建了mIL-10重組腺病毒載體,并通過對(duì)磷酸鈣轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化,高效地將重組腺病毒載體轉(zhuǎn)入HEK 293T細(xì)胞,并且成功表達(dá)