復(fù)制型乙型肝炎病毒載體表達(dá)病毒白細(xì)胞介素10建立小鼠感染模型.pdf

1、自從1963年Blumberg發(fā)現(xiàn)澳大利亞抗原以來(lái)，乙型肝炎病毒（HBV）感染一直是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的原因之一。慢性HBV感染所引起的慢性乙型病毒性肝炎及其相關(guān)疾病(如肝衰竭、肝硬化、肝癌等)是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病。目前尚無(wú)可靠的HBV動(dòng)物模型，嚴(yán)重阻礙了HBV相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究。因此，建立易獲取、經(jīng)濟(jì)適用、生物學(xué)背景清晰的小動(dòng)物HBV感染模型尤為重要。
　　小鼠是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但是，乙肝病毒的種屬特異性使得正常情

2、況下HBV不能感染小鼠。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型、人鼠嵌合小鼠HBV模型目前己經(jīng)在一定范圍內(nèi)得到應(yīng)用，但是這些模型的制備技術(shù)要求較高、制備難度大、免疫缺陷和肝細(xì)胞來(lái)源困難等因素也限制了其應(yīng)用。水動(dòng)力學(xué)方法建立的HBV轉(zhuǎn)染小鼠模型為HBV相關(guān)研究提供了很好的動(dòng)物模型，該模型制備具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用、簡(jiǎn)單易行等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于HBV感染免疫發(fā)病機(jī)制、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、抗病毒藥物篩選等方面的研究。
　　多種病毒通過(guò)發(fā)展各自的策略逃避宿主免疫，從而形成宿

3、主的慢性感染。很多病毒的基因產(chǎn)物可以減輕宿主的免疫反應(yīng)，避免免疫監(jiān)視與免疫清除，為病毒的持續(xù)存在提供良好的環(huán)境，從而成功地感染具有健全免疫系統(tǒng)的機(jī)體，實(shí)現(xiàn)與宿主共存。人皰疹病毒中的人巨細(xì)胞病毒（HumanCytomegalovirus，HCMV）和EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)都可以編碼病毒白細(xì)胞介素10（interleukin10，IL-10）類(lèi)似物，這些IL-10類(lèi)似物主要是抑制局部的免疫反應(yīng)，以增強(qiáng)病毒復(fù)制

4、、播散并持續(xù)存在。
　　本研究擬借用人巨細(xì)胞病毒和EB病毒的生存策略，通過(guò)制備表達(dá)人巨細(xì)胞病毒白細(xì)胞介素10（HumanCytomegalovirusinterleukin10，cmvIL-10）、EB病毒白細(xì)胞介素10(Epstein-Barrvirusinterleukin10，ebvIL-10)的復(fù)制型HBV載體，用水動(dòng)力學(xué)的方法探討建立小鼠HBV慢性感染模型的可行性。
　　第一部分表達(dá)cmvIL-10、ebvIL-1

5、0的復(fù)制型HBV載體的構(gòu)建
　　目的：把HBV改造為表達(dá)cmvIL-10、ebvIL-10的復(fù)制型HBV載體，分析其分子生物學(xué)特性及對(duì)小鼠免疫功能是否有抑制作用。
　　方法：
　　1、應(yīng)用基因重組技術(shù)，構(gòu)建了如下2個(gè)質(zhì)粒：pCH-cmvIL-10、pCH-ebvIL-10。以表達(dá)野生型HBV的質(zhì)粒pCH-3093為母質(zhì)粒，插入外源基因cmvIL-10和ebvIL-10，構(gòu)建表達(dá)人巨細(xì)胞病毒白細(xì)胞介素10(cmvIL-1

6、0)的質(zhì)粒pCH-cmvIL-10、表達(dá)EB病毒白細(xì)胞介素10(ebvIL-10)的質(zhì)粒pCH-ebvIL-10。
　　2、復(fù)制型HBV載體分子生物學(xué)特性的觀察：上述重組型HBV質(zhì)粒以表達(dá)野生型HBV的質(zhì)粒pCH-3093為對(duì)照，分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，提取細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液中的DNA，Southernblot檢測(cè)HBV的復(fù)制能力，Northernblot檢測(cè)HBVmRNA表達(dá)的變化。Nativewesternblot檢測(cè)

7、HBV核心蛋白的表達(dá)。
　　3、兩種病毒IL-10對(duì)小鼠免疫功能的抑制活性檢測(cè)
　　pCH-cmvIL-10、pCH-ebvIL-10和pCH-3093（對(duì)照）分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，收集含IL-10的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。分離小鼠外周血單核細(xì)胞，給予LPS刺激，同時(shí)給予含有病毒IL-10的細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)單核細(xì)胞內(nèi)MHC-IImRNA和TNF-αmRNA的表達(dá)，以觀察兩種病毒IL-10對(duì)小鼠免疫功能的

8、抑制作用。
　　結(jié)果：
　　1、本研究將HBV的P和C基因重疊區(qū)域分開(kāi)，通過(guò)插入外源基因cmvIL-10、ebvIL-10，利用2個(gè)IRES序列，成功構(gòu)建了表達(dá)cmvIL-10和ebvIL-10的復(fù)制型HBV載體質(zhì)粒pCH-cmvIL-10、pCH-ebvIL-10，經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定，與理論設(shè)計(jì)相同。
　　2、為觀察構(gòu)建的2種HBV載體的復(fù)制能力，通過(guò)Southernblot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)此兩個(gè)質(zhì)粒復(fù)制能力與野生型HBV相

9、比，略有下降。
　　3、為觀察2種HBV載體mRNA表達(dá)水平變化，通過(guò)Northernblot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種HBV載體由于外源基因的插入，pgRNA電泳較野生型HBV稍慢，sgRNA與野生型HBV一致。
　　4、為觀察兩種HBV載體是否對(duì)HBV核心蛋白有影響，通過(guò)Nativewesternblot檢測(cè)，證實(shí)所構(gòu)建的上述HBV載體對(duì)核心蛋白表達(dá)無(wú)影響，與野生型HBV一致。
　　5、為觀察兩種病毒IL-10對(duì)小鼠免疫功能的

10、抑制活性，通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小鼠單核細(xì)胞內(nèi)MHCIImRNA和TNF-αmRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比有不同程度的下降，表明兩種病毒IL-10在細(xì)胞水平對(duì)小鼠免疫功能的有抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1、把HBV的P和C基因重疊區(qū)域分開(kāi)，通過(guò)插入外源基因cmvIL-10、ebvIL-10，利用2個(gè)IRES序列，分別用于表達(dá)外源基因和P蛋白，成功構(gòu)建了可表達(dá)cmvIL-10、ebvIL-10的復(fù)制型HBV載體，且對(duì)H

11、BV分子生物學(xué)特性無(wú)明顯影響。
　　2、本研究所構(gòu)建的2種復(fù)制型HBV載體在細(xì)胞水平對(duì)小鼠免疫功能均有抑制作用。
　　第二部分利用水動(dòng)力學(xué)方法制備重組HBV小鼠感染模型
　　目的：水動(dòng)力學(xué)方法構(gòu)建重組HBV的小鼠HBV感染模型。
　　方法：
　　1、將清潔喂養(yǎng)、體重為22-25g、6-8周齡的Balb/c雄性小鼠，隨機(jī)等分為三組：1.pCH3093組；2.pCH-cmvIL-10組；3.pCH-ebvIL-

12、10組。每組32只。
　　2、采用水動(dòng)力注射法，每只動(dòng)物給予15ug質(zhì)粒，加入總體積為0.lml/g(體重)的生理鹽水中，5-7秒鐘內(nèi)通過(guò)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)。
　　3、按照以下時(shí)間點(diǎn)：注射后第l、3、5、7、10、14、21、28、60天，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)每組隨機(jī)取3只小鼠眼眶取血并取肝組織，測(cè)定如下指標(biāo)：
　?。?）ELISA測(cè)定小鼠血清中HBsAg、HBeAg；
　　（2）免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝組織中的HBcAg的表達(dá)