樹(shù)鼩慢性乙型肝炎病毒感染模型的探索.pdf

1、HBV感染人體以后可以造成急性肝炎、慢性肝炎,可發(fā)展為肝硬化,甚至導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變,嚴(yán)重影響人類(lèi)生命健康。雖然新生兒乙肝疫苗接種計(jì)劃有效降低了新發(fā)HBV感染的發(fā)生率,但對(duì)于全世界已有的龐大HBV慢性感染人群仍缺乏徹底、有效的治療措施。
　　對(duì)HBV感染致病機(jī)制的研究及防治藥物的研發(fā)離不開(kāi)合適的動(dòng)物感染模型。長(zhǎng)期以來(lái),黑猩猩是唯一可以被用于HBV感染研究的易感動(dòng)物。然而,黑猩猩屬于瀕危珍稀動(dòng)物、來(lái)源受限,其相對(duì)大型的體格、昂貴的使用成

2、本,以及受到倫理因素影響,黑猩猩作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用越來(lái)越受到限制。因此,人們迫切需要尋找其他更加方便、穩(wěn)定的小型動(dòng)物作為模型以利于HBV研究的開(kāi)展。
　　由于其嚴(yán)格的宿主特異性,HBV感染難以在除人類(lèi)和黑猩猩以外的其他動(dòng)物實(shí)現(xiàn),很多關(guān)于HBV的認(rèn)識(shí)都是通過(guò)對(duì)與HBV相似的其他病毒的研究獲得的。鴨乙型肝炎病毒(DuckhepatitisBvirus,DHBV)和土撥鼠肝炎病毒(Woodchuckhepatitisvirus,WHV)

3、與HBV同屬嗜肝DNA病毒,它們?cè)诟髯运拗黧w內(nèi)的感染為人們了解屬嗜肝DNA病毒的感染復(fù)制周期及宿主免疫系統(tǒng)反應(yīng)提供了大量依據(jù)。但是鴨和土撥鼠與人類(lèi)的遺傳背景差異較大,免疫背景不明確,檢測(cè)手段相對(duì)缺乏,加之上述肝炎病毒與HBV的種屬差異,從這些替代模型觀察到的現(xiàn)象并不能完全真實(shí)的反應(yīng)人類(lèi)感染HBV的情況。
　　小鼠是應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。用于HBV研究的小鼠模型包括HBV轉(zhuǎn)基因小鼠、水動(dòng)力注射HBV基因組小鼠以及人/樹(shù)鼩—小鼠肝臟嵌

4、合體模型。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠被轉(zhuǎn)入了含有HBV完整基因組或部分基因組片段的HBVDNA,可以產(chǎn)生具有感染力的完整病毒顆粒或各種病毒成分;但是轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)HBV免疫耐受,不能用于機(jī)體免疫反應(yīng)及機(jī)體清除病毒機(jī)制的研究。水動(dòng)力注射小鼠模型是將HBVDNA或含有HBVDNA的載體通過(guò)尾靜脈高壓注入血液中,使HBVDNA富集于肝臟并進(jìn)入肝細(xì)胞,發(fā)生HBVDNA的復(fù)制和表達(dá);此模型中HBV不能感染新的小鼠肝細(xì)胞,有限的HBV很快被免疫系統(tǒng)清除,不能用

5、于HBV慢性感染的研究。常用的肝臟嵌合體小鼠包括uPA/Rag2-/-小鼠、uPA/SCID、Fah?/?/Rag2?/?/Il2rg?/?(FRG)小鼠和Fah-/-/NOD/SCID小鼠等,這些嵌合體小鼠因被植入人類(lèi)或樹(shù)鼩肝細(xì)胞后能夠感染HBV,病毒血癥可以達(dá)到較高水平并維持較長(zhǎng)時(shí)間。該模型的主要缺陷是這些小鼠的純系繁殖體系的建立困難,并且缺乏成熟的特異性免疫系統(tǒng),不能用于研究宿主免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的作用。
　　樹(shù)鼩(treesh

6、rews,tupaia)是一種外形類(lèi)似松鼠的小型哺乳動(dòng)物,在系統(tǒng)進(jìn)化上與靈長(zhǎng)類(lèi)關(guān)系密切,人們?cè)絹?lái)越關(guān)注其在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用。目前,樹(shù)鼩已經(jīng)被用做近視、糖尿病、社會(huì)應(yīng)激和抑郁癥等疾病的動(dòng)物模型。除此以外,樹(shù)鼩還可以被人皰疹病毒(herpesvirushominis)、單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)、博爾納病病毒(Bornadiseasevirus)、輪狀病毒(humanrotavirus)和丙型肝炎病毒(hepa

7、titisCvirus,HCV)等人類(lèi)病毒感染,被廣泛應(yīng)用多種病毒感染性疾病的研究。
　　從20世紀(jì)80年代開(kāi)始,國(guó)內(nèi)外陸續(xù)有報(bào)道證實(shí),樹(shù)鼩接種HBV后能在肝臟中檢測(cè)到HBV的感染和復(fù)制。雖然樹(shù)鼩已被證實(shí)能夠發(fā)生HBV感染,但其感染過(guò)程多為一過(guò)性,鮮有關(guān)于樹(shù)鼩慢性HBV感染的報(bào)道。樹(shù)鼩體內(nèi)HBV感染過(guò)程的短暫性使其不適于HBV慢性感染的研究,也不利于慢性乙型肝炎治療措施的評(píng)價(jià)。
　　在黑猩猩體內(nèi)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明病毒接種劑量對(duì)H

8、BV感染時(shí)限有顯著影響,其中101GEHBV接種主要導(dǎo)致慢性感染過(guò)程。此外,多個(gè)報(bào)道證實(shí)用免疫抑制劑抑制機(jī)體免疫功能,可以使體內(nèi)病原體感染的清除延遲。這為我們探索樹(shù)鼩體內(nèi)HBV慢性感染的條件提供了線(xiàn)索。本課題通過(guò)調(diào)整病毒接種劑量和持續(xù)免疫抑制兩種方使樹(shù)鼩接感染HBV,觀察處理措施對(duì)樹(shù)鼩體內(nèi)HBV感染進(jìn)程的影響,以探索有利于延長(zhǎng)樹(shù)鼩體內(nèi)HBV感染時(shí)限的條件,為慢性HBV感染樹(shù)鼩模型的建立提供借鑒。
　　我們首先研究了病毒接種劑量對(duì)樹(shù)

9、鼩體內(nèi)HBV感染進(jìn)程的影響。成年雄性樹(shù)鼩分別經(jīng)腹腔接種含有101GE、102GE、104GE和108GEHBV的人類(lèi)血清后,于特定時(shí)間點(diǎn)采集樹(shù)鼩血清,用于HBVDNA、HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAg和ALT的檢測(cè),觀察HBV感染后的血清學(xué)指標(biāo)變化趨勢(shì)。此外,還通過(guò)活體取肝采集樹(shù)鼩肝組織標(biāo)本,用于檢測(cè)感染HBV后樹(shù)鼩肝組織中HBV特異抗原表達(dá)、HBVcccDNA含量以及病理學(xué)變化。結(jié)果顯示,以上不同劑量的HBV

10、接種后均能在血清中檢測(cè)到HBsAg、HBeAg和HBVDNA,經(jīng)過(guò)不同時(shí)間后出現(xiàn)HBeAb和HBsAb,發(fā)生HBsAg和HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換,最終HBVDNA轉(zhuǎn)陰,HBV感染被清除。肝組織免疫組化染色能檢測(cè)到HBsAg和HBcAg陽(yáng)性肝細(xì)胞的存在,并有HBVcccDNA的形成,更加充分證實(shí)了樹(shù)鼩體內(nèi)HBV感染的成功建立。樹(shù)鼩接種HBV后能觀察到血清中ALT水平升高,肝組織HE染色顯示存在肝細(xì)胞變性壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變,表明HB

11、V感染樹(shù)鼩能造成與人類(lèi)乙型肝炎相似的病理變化。綜合血清學(xué)和組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析,108GEHBV引起的HBV感染不超過(guò)3周,104GEHBV引起的HBV感染長(zhǎng)達(dá)15周,101GE和102GEHBV引起的HBV感染均維持9周。據(jù)此,我們認(rèn)為病毒接種劑量能顯著影響樹(shù)鼩體內(nèi)HBV的感染時(shí)限,其中104GEHBV最有利于樹(shù)鼩HBV感染的維持。
　　此外,我們?cè)谝唤M樹(shù)鼩注射含HBV血清后還給予了隔天一次的氫化可的松注射,以觀察持續(xù)免疫抑制對(duì)樹(shù)

12、鼩感染HBV進(jìn)程的影響。由于免疫抑制,本組樹(shù)鼩容易發(fā)生其他病原體感染,所有樹(shù)鼩均在接種HBV后的12周內(nèi)死亡。在有限的觀察期內(nèi),該組樹(shù)鼩血清中HBVDNA、HBsAg和HBeAg持續(xù)陽(yáng)性,肝組織中HBsAg和HBeAg陽(yáng)性肝細(xì)胞持續(xù)存在,HBVcccDNA也能被持續(xù)檢出。直至觀察終點(diǎn)(第84天所有樹(shù)鼩死亡),本組所有樹(shù)鼩體內(nèi)的HBV均未被清除,說(shuō)明本組樹(shù)鼩的HBV感染至少能維持12周。這些結(jié)果表明,用氫化可的松持續(xù)抑制樹(shù)鼩免疫功能可以顯

13、著延長(zhǎng)HBV的感染時(shí)限。
　　通過(guò)本實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)成年樹(shù)鼩能建立有效的HBV感染。樹(shù)鼩接種含HBV的血清后,可以在其血清中檢測(cè)到HBVDNA、HBsAg和HBeAg,肝組中有HBsAg和HBcAg的表達(dá)以及HBVcccDNA的形成,并出現(xiàn)與人類(lèi)乙型肝炎相似的病理改變。我們發(fā)現(xiàn)病毒接種劑量和機(jī)體免疫狀態(tài)對(duì)樹(shù)鼩體內(nèi)的HBV感染進(jìn)程有明顯影響,104GEHBV接種和持續(xù)免疫抑制處理有利于HBV感染的維持。我們的研究為新型的HBV慢性感染