新生期樹(shù)鼩接種人乙型肝炎病毒的長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)觀察.pdf

1、目的:應(yīng)用分子生物學(xué)、免疫學(xué)等多種方法，對(duì)新生期樹(shù)鼩接種人乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)后體內(nèi)HBV感染標(biāo)志進(jìn)行長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)觀察。 方法: 第一部分：優(yōu)化巢氏聚合酶鏈反應(yīng)(nestedpolymerasechainreaction，nPCR)，主要內(nèi)容有：①血清模板制備：分別用直接煮沸法、堿裂解法抽提血清HBVDNA，比較各抽提方法的目的基因得率、靈敏度及重復(fù)性。②引物設(shè)計(jì)：HBV基因S區(qū)，C區(qū)保守區(qū)

2、段中分別設(shè)計(jì)兩套nPCR引物，對(duì)引物的擴(kuò)增效率進(jìn)行比較。 第二部分：nPCR聯(lián)合其它方法檢測(cè)6只新生期接種HBV的樹(shù)鼩血清和肝組織標(biāo)本，主要內(nèi)容有：①應(yīng)用nPCR和熒光定量聚合酶連反應(yīng)(fluorescencequantitativePCR，F(xiàn)Q-PCR)檢測(cè)樹(shù)鼩血清和肝組織中HBVDNA水平。②應(yīng)用nPCR和Southernblot檢測(cè)樹(shù)鼩肝組織的HBVcccDNA。③應(yīng)用ELISA和免疫組織化學(xué)方法觀察樹(shù)鼩血清和肝組織中HB

3、V標(biāo)志物。④用電子顯微鏡尋找肝組織內(nèi)的HBV穎粒。⑤用光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理變化。 結(jié)果: 第一部分：①在兩種抽提方法中，堿裂解法在目的基因得率、靈敏度、重復(fù)性等方面均優(yōu)于直接煮沸法。②在HBV基因組的C區(qū)、S區(qū)各篩選出一套引物。 第二部分：①用HBVC區(qū)、S區(qū)引物進(jìn)行nPCR檢測(cè)血清標(biāo)本，結(jié)果為1、2和6號(hào)三只動(dòng)物接種后第20周穩(wěn)定地顯示陽(yáng)性條帶至48周，其余3只動(dòng)物始終陰性；用以上引物檢測(cè)肝組織標(biāo)本，6只動(dòng)

4、物接種后第12周至48周持續(xù)顯示陽(yáng)性。DNA測(cè)序結(jié)果顯示以上血清及肝組織中擴(kuò)增出的HBVDNAC區(qū)和S區(qū)片段與人HBV相應(yīng)片段的同源性分別為96.0％和98.0％。②FQ-PCR檢測(cè)血清結(jié)果顯示1、2號(hào)和6號(hào)樹(shù)鼩在接種后第20～48周內(nèi)HBVDNA拷貝數(shù)為103～104/ml，其余3只動(dòng)物的血清HBVDNA始終為陰性；FQ-PCR檢測(cè)肝組織結(jié)果顯示，1、2和6號(hào)動(dòng)物在接種后第24周～48周HBVDNA拷貝數(shù)為107～108/μg肝組織總

5、DNA，其余3只動(dòng)物一直維持在103～104/μg肝組織總DNA7水平。③nPCR檢測(cè)1、2和6號(hào)樹(shù)鼩肝組織中的HBVcccDNA結(jié)果顯示陽(yáng)性；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和同源性比較，顯示與人HBV相應(yīng)片段序列的同源性為100％。④Southemblot檢測(cè)1、2和6號(hào)樹(shù)鼩肝組織中的HBVDNA，結(jié)果顯示HBV復(fù)制中間體HBVcccDNA和HBVssDNA，并且這些HBV復(fù)制中間體在接種后第12、24和36周有逐漸增加的趨勢(shì)。⑤ELISA檢測(cè)結(jié)果

6、顯示1、2和6號(hào)樹(shù)鼩接種后第12、24、36和48周的4次血清標(biāo)本均呈HBsAg陽(yáng)性；其余3只動(dòng)物中，1只在24周前出現(xiàn)HBsAg陽(yáng)性，以后轉(zhuǎn)為陰性，另兩只動(dòng)物的HBsAg檢測(cè)始終為陰性。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示1、2和6號(hào)樹(shù)鼩肝組織中可檢測(cè)到HBsAg，并且HBsAg陽(yáng)性肝細(xì)胞的數(shù)量隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)有逐漸增多的趨勢(shì)；另外3只動(dòng)物多次肝活檢組織的HBsAg標(biāo)志始終為陰性。⑥電鏡下1號(hào)動(dòng)物的肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)直徑接近40nm的致密球形顆粒，疑