乙型肝炎病毒基因分型方法的建立.pdf

1、【研究背景】
　　乙型肝炎病毒HBV（hepatitisBvirus）是指引起人類急、慢性肝炎的DNA病毒，也稱丹氏顆粒。HBV基因組（HBV-DNA）由雙鏈不完全環(huán)形結(jié)構(gòu)的DNA組成，含約3200個核苷酸，主要分為P、C、X、S四個區(qū)。HBVDNA具有高度突變性，并由此形成了HBVDNA不同的亞型。研究發(fā)現(xiàn)高度重疊性和mRNA逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制中間體是其高突變的主要誘因。根據(jù)全基因序列異質(zhì)性≥8％且同源性<92％，將其分為8個基因型（A

2、、B、C、D、E、F、G、H）。目前對HBV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)是全基因組測序，之后根據(jù)HBV基因全序列比對，產(chǎn)生了S基因區(qū)分型標(biāo)準(zhǔn)，即通過比對HBV基因組的S基因區(qū)，以異質(zhì)性≥4％且同源性<96％進(jìn)行分型，S區(qū)具有較高的保守性，因此S基因區(qū)分型標(biāo)準(zhǔn)不僅具有分型有效性，并且對全基因組分型方法進(jìn)行了簡化和優(yōu)化。
　　我國是乙肝發(fā)病大國，就目前的流行病學(xué)統(tǒng)計來看，中國的乙肝基因型主要為A、B、C、D這四種基因型，并且發(fā)現(xiàn)了不同基因型的HB

3、V的致病性所存在的差異，其基因型與乙型肝炎病情的進(jìn)展、臨床表現(xiàn)、治療耐藥、預(yù)后有著密切的關(guān)系。然而對于HBV的早期檢測和分型，至今仍無準(zhǔn)確有效的檢測方法，因此，建立一種高效、準(zhǔn)確、易于普及的對HBV進(jìn)行基因型分析的方法有利于我國衛(wèi)生事業(yè)對乙型肝炎的治療前診斷和治療實施。
　　【研究方法】
　　本實驗立足于對HBV進(jìn)行基因分型，通過生物信息學(xué)分析比對了全球49個HBV全基因，其中包括14個NCBI中作為參考標(biāo)準(zhǔn)的HBV標(biāo)準(zhǔn)株基

4、因型，另外將此結(jié)果同時與中國提交給Genbank的部分HBV全基因比較，最終選擇HBV病毒8種基因型的PreS2和S區(qū)共同保守序列進(jìn)行擴(kuò)增，并在選擇的區(qū)域中進(jìn)一步挑選每種基因型特有的檢測位點設(shè)計相應(yīng)探針，采用反向核酸雜交技術(shù)，結(jié)合BAS通過ABS-ELISA和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對擴(kuò)增的PreS2和S區(qū)檢測片段進(jìn)行快速雜交反應(yīng)，建立一種新型SNP位點檢測方法，進(jìn)而完成對HBV基因型別的區(qū)分。
　　【研究結(jié)果】
　　1證實PreS2

5、、PreS1、S基因區(qū)具有重要的分型意義
　　通過大規(guī)模多重比對HBV基因組序列，發(fā)現(xiàn)HBVDNA的S區(qū)具有型內(nèi)高度保守、型間差異性大的位點，且這些位點在HBV基因組高突變情況下仍然可作為分型依據(jù)。同時在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品測序比對過程中，證實了這些位點的高度保守性和型間差異性。而相對于P區(qū)、C區(qū)和X區(qū)比較，均未發(fā)現(xiàn)較高的連續(xù)型內(nèi)保守區(qū)段。證明S基因區(qū)對HBV基因型具有重要的分型意義。
　　2獲得西安地區(qū)HBV基因型分布趨勢
　

6、　通過對282例西安地區(qū)乙肝患者抽取血清并提取HBVDNA進(jìn)行構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品并測序比對其HBV基因型，獲得了的西安地區(qū)乙肝感染者的HBV基因型分布比例，未見A型，B型占14.5％，C型占81.9％，D型占3.6％，此統(tǒng)計數(shù)據(jù)不同于以往流病調(diào)查的B型和C型比例相近的結(jié)果，有文獻(xiàn)稱HBVC型較HBVB型患者繼發(fā)肝硬化、肝癌的比例要高，此實驗統(tǒng)計結(jié)果可通過對采血病人進(jìn)行追蹤調(diào)查證實HBV患者繼發(fā)癥和HBV基因型的關(guān)系。
　　3建立了一種具有

7、高效、快速、準(zhǔn)確優(yōu)勢的分型方法
　　此方法同其他HBV的分型檢測方法相比，可以針對單堿基進(jìn)行區(qū)分檢測，其靈敏度不遜色于其他方法依賴機(jī)器的檢測；不依賴于高昂的設(shè)備和嚴(yán)格的反應(yīng)條件，比其他方法更容易推廣；該方法檢測具有較快的檢測速度同時檢測條件簡便，水浴條件下雜交即可完成檢測，通過擴(kuò)大單個膜塊面積和相應(yīng)增多探針數(shù)量則可完成高通量檢測；該方法的檢測范圍就HBV分型已經(jīng)完成630bp長度的片段捕獲，更利于探針設(shè)計和樣本制備。
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