乙型肝炎病毒基因組EnhI突變分析及其意義.pdf

1、人感染乙型肝炎病毒(hepatitis b vius,HBV)后可導(dǎo)致急性自限性肝炎,或者轉(zhuǎn)為慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)。盡管只有3～10％個(gè)體感染HBV后成為CHB患者,但據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)全世界超過20億人感染過HBV,CHB人口仍巨大。我國(guó)多年來一直是HBV感染的高流行區(qū),全國(guó)約有1.2億CHB患者。乙型肝炎慢性化的機(jī)制比較復(fù)雜,仍然有待進(jìn)一步闡述。
　　 HBV感染人體后,特異性T、B

2、淋巴細(xì)胞可清除病毒。然而CHB患者在感染急性期HBV DNA水平較高,進(jìn)入慢性期后HBV DNA水平維持在較低水平,免疫系統(tǒng)未能成功清除病毒,導(dǎo)致了HBV持續(xù)存在。目前較多的研究認(rèn)為HBV結(jié)構(gòu)基因選擇性突變逃避宿主免疫監(jiān)測(cè),但HBV調(diào)控序列中增強(qiáng)子的變異對(duì)HBV基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制水平的下調(diào)作用導(dǎo)致感染慢性化的機(jī)制卻較少報(bào)道。HBV基因組上有二個(gè)增強(qiáng)子序列。研究表明HBV增強(qiáng)子Ⅰ(enhancerⅠ,EnhⅠ)對(duì)HBV基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制起

3、重要調(diào)控作用,其序列上的突變與HBV感染慢性化的相關(guān)性未見報(bào)道。
　　 本研究擬選取CHB患者,采用PCR技術(shù)對(duì)HBV EnhⅠ區(qū)域DNA進(jìn)行擴(kuò)增并直接測(cè)序,采用Genotyping軟件分析序列并鑒定其基因型(genotype),利用DNAMAN軟件將獲得的HBV序列與genebank上相應(yīng)基因型HBV參考株序列比對(duì)以分析變異,同時(shí)檢測(cè)血清中HBV DNA水平、免疫學(xué)指標(biāo)HBsAg、HBeAg滴度,分析EnhⅠ基因變異與HBV

4、DNA水平、HBsAg和HBeAg滴度的關(guān)聯(lián)性,以分析EnhⅠ基因變異對(duì)乙肝慢性化的影響。
　　 目的(1)比較Taq PCR MasterMix和Taq Plus PCR MasterMix擴(kuò)增HBV靶DNA保真度影響。(2)研究江西地區(qū)CHB患者體內(nèi)HBV EnhⅠ區(qū)域基因變異。(3)研究CHB患者HBV EnhⅠ基因變異對(duì)血清HBV DNA水平及HBsAg、HBeAg滴度影響。
　　 方法：(1)取CHB患者血清與

5、陰性對(duì)照血清標(biāo)本各一份,抽提血清中DNA,采用Taq PCR MasterMix和Taq Plus PCR MasterMix分別擴(kuò)增HBV DNAnt835-nt1396片段,PCR產(chǎn)物測(cè)序并DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)。(2)收集來我院就診的CHB患者70名,其中“大三陽(yáng)”35例,“小三陽(yáng)”35例,健康體檢者2名血清,PCR擴(kuò)增HBV EnhⅠ基因,產(chǎn)物測(cè)序后利用Genbank中Genotyping對(duì)HBV進(jìn)行分型,利用DNAMAN軟件

6、與標(biāo)準(zhǔn)株比對(duì)分析DNA序列中的變異位點(diǎn)。熒光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)法定量檢測(cè)血清HBV DNA拷貝數(shù),倍比稀釋血清后用ELISA法檢測(cè)HBsAg、HBeAg滴度。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,HBV DNA拷貝數(shù)以其對(duì)數(shù)值計(jì)算(x)±S,滴度均值采用幾何均數(shù)表示。陽(yáng)性率比較采用x2檢驗(yàn),組間比較HBV DNA拷貝數(shù)陽(yáng)性對(duì)數(shù)均值差異采用多應(yīng)變量方差分析,兩兩比較均采用不假

7、定方差相等Dunnett’s T3檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：(1)二種PCR試劑均能特異地?cái)U(kuò)增出HBV靶基因片段,PCR產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示,Taq PCR MasterMix擴(kuò)增產(chǎn)物與Taq Plus PCR MasterMix擴(kuò)增產(chǎn)物相比,產(chǎn)生了nt1390缺失和nt1389T→C及nt1392G→T二個(gè)突變位點(diǎn)。(2)70例乙肝患者HBV DNA測(cè)序后經(jīng)Genotyping比對(duì),均屬于B型,與參考

8、序列AF100309同源性最高,CHB患者HBV ErdaⅠ主要變異位點(diǎn)為:nt1010A→T,nt1013G→A,nt1031T→C,nt1034A→G,nt1053C→T,nt1082A→T,nt1133G→A,nt1167C→T,nt1223C→A,nt1227G→C,nt1230A→C,nt1241T→A,nt1244G→A,nt1246C→A,m1251C→G,m1289A→C,nt1349A→C。(4)CHB患者HBV En

9、hⅠ區(qū)域nt1133G→A變異對(duì)應(yīng)的HBV DNA拷貝數(shù)與HBsAg、HBeAg滴度明顯降低。
　　 結(jié)論：(1)兩種不同PCR試劑中Taq和Pfu混合DNA聚合酶的Taq Plus PCRMasterMix試劑催化PCR反應(yīng)中HBV靶DNA片段擴(kuò)增的保真度高于Taq DNA聚合酶。(2)江西地區(qū)乙肝患者感染HBV基因型主要為B型,HBV EnhⅠ區(qū)域nt1133G→A可降低EnhⅠ功能,下調(diào)HBV基因表達(dá),ErdaⅠ區(qū)域基因變