乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥突變及其基因型的研究.pdf

1、研究背景： 乙型肝炎病毒感染在世界范圍廣泛流行，僅慢性HBV攜帶者就有近4億人之多。HBV感染不僅可導(dǎo)致急、慢性病毒性肝炎，而且還可發(fā)展為肝硬化及肝細胞癌，每年導(dǎo)致大約100萬人死亡，嚴重影響了人類的健康。拉米夫定是一種脫氧胞嘧啶核苷類似物，它可以明顯抑制HBV的復(fù)制從而減少病毒的總負荷量。但是，應(yīng)用該藥6個月以上，HBVP基因區(qū)YMDD基序即酪氨酸(Y)-蛋氨酸(M)-天門冬氨酸(D)-天門冬氨酸(D)中204位蛋氨酸(M)被

2、纈氨酸(V)或異亮氨酸(Ⅰ)取代，生成YVDD、YIDD或YSDD，從而產(chǎn)生耐藥性。在204位密碼子發(fā)生突變的同時常會出現(xiàn)180位密碼子的聯(lián)合突變。拉米夫定耐藥后會使病人血清DNA升高，甚至使病人的病情惡化。近年研究發(fā)現(xiàn)，HBV基因型的類別與HBV的感染途徑、自然史、臨床表現(xiàn)、藥物療效、病毒變異以及疾病進展有關(guān)。到目前為止，根據(jù)HBV核苷酸全序列異質(zhì)≥8％或表面抗原S基因序列核苷酸差異度≥4％，已將乙肝病毒株分為A到H8種基因型。由于不

3、同基因型的HBV在流行特征、致病性、對藥物治療反應(yīng)等方面存在差異，因此了解HBV基因型具有重要的臨床意義。 目前，用于檢測乙肝病毒拉米夫定耐藥突變的方法主要有：(1)直接測序法，該方法一直被認為是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)；(2)限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)技術(shù)，即利用限制性內(nèi)切酶對DNA特定序列專一性識別并進行切割的特點，對目的DNA進行酶切，則不同的序列就會被切割成長短不一的DNA片斷，再通過凝膠電泳觀察酶切結(jié)果，然后對酶

4、切圖像進行多態(tài)性分析來確定基因的突變情況；(3)基因芯片技術(shù)；(4)聚合酶鏈反應(yīng)微板核酸雜交-酶聯(lián)免疫黏附法聚合酶鏈反應(yīng)微板核酸雜交-酶聯(lián)免疫黏附法法是一種將基因擴增、核酸雜交和酶聯(lián)顯色3種診斷技術(shù)為一體的檢測技術(shù)；(5)實時熒光定量PCR；(6)變性高效液相色譜(DHPLC)。 用于乙肝病毒基因分型的方法有：(1)HBV全基因測序，是HBV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)；(2)表面抗原S基因序列測定，以上這2種方法均需時費力、較為繁瑣，不適

5、合流行病學(xué)調(diào)查；(3)表面抗原S基因聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析；此方法靈敏度較高、特異性較強，能較準(zhǔn)確地鑒定HBV基因型，可用于HBV基因型的流行病學(xué)調(diào)查，但步驟較繁雜、易受污染、酶切位點易受基因變異的影響；(4)HBV基因型特異性表位單克隆抗體免疫吸附法。本法對于不同基因型混合感染或基因型特異性表位存在點突變時不能分型，同時需要建立一套單克隆抗體；(5)HBV基因型特異性引物PCR；(6)酶聯(lián)免疫吸附法該方法雜交時間短、分

6、型較可靠、自動化程度高，可大規(guī)模進行HBV基因分型。但是，該方法測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在臨床檢驗中除正常反應(yīng)外，有時?？梢姷揭恍╁e誤結(jié)果，即假陽性或假陰性結(jié)果。(7)基因芯片技術(shù)該技術(shù)用于乙型肝炎病毒的基因分型檢測有很多潛在的優(yōu)勢，但在實現(xiàn)過程中還有許多需待解決的問題。 研究目的： 優(yōu)化RFLP，實時熒光PCR和變性高效液相色譜三種檢測方法用于乙肝病毒拉米夫定耐藥突變檢測和乙肝病毒基因分型，并

7、對三種方法的檢測結(jié)果進行比較、評估，確定能快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、適用于臨床的針對乙肝病毒耐藥突變和對乙肝病毒進行基因分型的檢測方法。 通過將檢測結(jié)果與臨床資料進行對比分析，進而探索乙肝病毒拉米夫定耐藥突變、基因亞型與臨床的相關(guān)性。 研究方法： 1.RFLP檢測乙肝病毒拉米夫定耐藥突變及對乙肝病毒進行基因型分析：首先，根據(jù)blast比對分析和相關(guān)文獻報道設(shè)計突變引物和基因分型的引物；然后，優(yōu)化最佳酶切體系；最后，將PC

8、R純化產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察酶切結(jié)果，進而確定乙肝病毒拉米夫定耐藥突變情況并確定乙肝病毒基因型。 2.實時熒光PCR方法檢測乙肝病毒拉米夫定耐藥突變并對乙肝病毒進行基因分型：首先，根據(jù)乙肝病毒拉米夫定用藥突變位點設(shè)計7對突變檢測引物，用于乙肝病毒拉米夫定耐藥突變的檢測；乙肝病毒分為A-H8種基因型，我國主要是B，C，D三種基因型，因此設(shè)計主要用于檢測B，C，D三種基因型的引物設(shè)計；然后，采用SYBRGreenI染

9、料法并結(jié)合touch-down程序優(yōu)化實時熒光PCR反應(yīng)進行乙肝病毒的突變檢測和乙肝病毒基因分型，為了提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性采用△Ct值進行檢測結(jié)果的判斷。 3.變性高效液相色譜方法檢測乙肝病毒拉米夫定耐藥突變并對乙肝病毒進行基因分型：首先，設(shè)計用于DHPLC檢測乙肝病毒突變的單堿基延伸引物和用于DHPLC進行乙肝病毒基因分型的多重PCR引物；然后優(yōu)化單堿基延伸反應(yīng)條件和多重PCR反應(yīng)條件；檢測乙肝病毒拉米夫定耐藥突變時先進行單堿

10、基延伸反應(yīng)，然后將PCR產(chǎn)物純化，純化后的產(chǎn)物在完全變性的條件下進行DHPLC分析，即在DNA片段單鏈狀態(tài)下將不同長度的片段分離，然后根據(jù)不同的色譜峰確定不同的突變類型。DHPLC進行乙肝病毒基因分型時，先將乙肝病毒DNA進行多重PCR擴增，然后將PCR產(chǎn)物直接在柱溫均為50℃，即在非變性條件下進行DHPLC分析，根據(jù)不同長度DNA滯留Sep柱時間的不同，將不同長度的片段分離。根據(jù)形成的不同的色譜峰來確定不同的基因型。 研究結(jié)果

11、： 1.RFLP方法檢測211例血清標(biāo)本，其中116例來自服用拉米夫定6個月以上的患者，在這116例標(biāo)本中檢測到含有不同突變類型的乙肝病毒：含有M204I、M204V、M204I+M204V、M204+M204I、M204+M204V、L180M、L180M+M204I、L180M+M204V突變型乙肝病毒的標(biāo)本數(shù)分別是31例(26.7％)，24例(20.7％)，15例(12.9％)，11例(9.48％)，10例(8.62％)，

12、13例(11.2％)，21例(18.1％)，17例(14.7％)。在服用拉米夫定少于6個月的21位患者血清中檢測到有1例標(biāo)本中含有M201I突變型乙肝病毒，在74例未曾接受過拉米夫定治療的患者血清中，有1例標(biāo)本中含有M201I突變型乙肝病毒。在211例標(biāo)本中13例血清標(biāo)本中含有B基因型的乙肝病毒，20例含有B、C混合型的乙肝病毒，其余的均為含有C基因型的乙肝病毒。 2.實時熒光PCR方法檢測乙肝病毒拉米夫定耐藥突變和對乙肝病毒基

13、因分型：優(yōu)化出了實時熒光PCR進行乙肝病毒耐藥突變檢測和基因分型的反應(yīng)條件，并確定了實時熒光PCR進行乙肝病毒耐藥突變檢測和基因分型的標(biāo)準(zhǔn)。在被檢測的211例血清標(biāo)本中，119(56.4％)例標(biāo)本中含有野生型乙肝病毒，33(15.6％)例標(biāo)本中含有M204I突變型乙肝病毒，20(9.5％)例標(biāo)本中含有M204V突變型乙肝病毒，M204I+M204V混合突變型病毒存在于12(5.7％)例標(biāo)本中，M204+M204I混合突變型病毒存在于14

14、(6.6％)例標(biāo)本中，13(6.2％)例標(biāo)本中含有M204+M204V混合突變型乙肝病毒；含有L180M突變型乙肝病毒的標(biāo)本數(shù)為18(8.5％)例，24(11.4％)和22(10.4％)例標(biāo)本中分別含有L180M+M204I，和L180M+M204V混合突變型乙肝病毒。在211例標(biāo)本中12例血清標(biāo)本中含有B基因型的乙肝病毒，24例含有B、C混合型的乙肝病毒，其余的均為含有C基因型的乙肝病毒。 3.DHPLC方法檢測乙肝病毒拉米夫

15、定耐藥突變和對乙肝病毒基因分型：優(yōu)化出了單堿基延伸反應(yīng)和多重PCR反應(yīng)的條件，并優(yōu)化了DHPLC進行突變檢測和乙肝病毒基因分型的條件，采用變性高效液相色譜方法成功地進行乙肝病毒拉米夫定耐藥突變檢測和乙肝病毒基因分型，建立了乙肝病毒拉米夫定耐藥突變和乙肝病毒基因型的標(biāo)準(zhǔn)色譜峰。 4.通過將檢測結(jié)果與臨床資料進行相關(guān)性分析，得出了乙肝病毒拉米夫定耐藥突變和乙肝病毒基因型與臨床的相關(guān)性：通過x2檢驗，乙肝病毒拉米夫定耐藥突變與患者的性

16、別、血清DNA水平、病毒基因型之間沒有相關(guān)性(P＞0.05)，而乙肝病毒拉米夫定耐藥突變與患者服用拉米夫定的時間長短有相關(guān)性(P＜0.05)，用藥時間越長，發(fā)生突變的幾率越大。乙肝患者服用拉米夫定后，180位點的突變和204位點突變具有相關(guān)性(P＜0.05)。 結(jié)論： 本課題通過對三種檢測方法及其檢測結(jié)果的比較、分析和評估認為：實時熒光PCR和DHPLC這兩種實驗方法更適于臨床大規(guī)模檢測乙肝病毒耐藥突變及對乙肝病毒進行基