乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥株變異率快速檢測方法的建立及應用研究.pdf

1、全世界有3.5億乙肝病毒感染者。乙肝病毒(HBV)是導致肝硬化和肝癌的重要因素，60％~-80％的肝癌患者是乙肝病人。隨著對乙肝病毒治療的深入研究，各種抗病毒藥物應運而生。拉米夫定是有效抑制乙肝病毒復制的核苷類似物之一。但是，長時間用藥會導致乙肝病毒出現(xiàn)YMDD區(qū)段發(fā)生變異，即HBV逆轉錄酶的保守序列YMDD中M(蛋氨酸)被V(纈氨酸)或I(異亮氨酸)所取代，變異后成為YVDD(rtM204V)或YIDD(rtM204I)，導致HBV對

2、拉米夫定產生耐藥，使患者體內病毒復制反彈。 本研究通過設計變異位點的選擇性引物及共用探針，利用熒光定量PCR技術，建立了一種快速、有效的乙肝病毒YMDD變異率的檢測方法。突變毒株在病毒群體中的百分比可以根據(jù)突變株和對照的Ct值差異進行計算。包含耐藥突變的質粒經過系列稀釋、混合后進行檢測，以及對未經拉米夫定治療的98例慢性乙肝患者和145例拉米夫定治療的慢性乙肝患者進行耐藥突變檢測，與測序方法進行對照，對結果不符的標本再進行亞克隆

3、測序驗證。并用該方法對268例經拉米夫定治療的不同時間患者進行病毒變異率檢測。對98例經拉米夫定治療和64例經拉米夫定與干擾素a序貫治療的e抗原陰性患者進行病毒變異率檢測，驗證序貫治療的效果及其對拉米夫定變異的抑制作用。同時，對患者體內的T淋巴細胞活性及T淋巴細胞亞群情況、肝組織治療前后病理學變化等進行了進一步分析。 該方法可以在106～109拷貝/毫升HBV的血清標本中檢測到0.1％的突變毒株。145例拉米夫定治療的慢性乙肝患

4、者中，檢測到42例耐藥突變株，突變比例為5～10096。6例與測序結果不符的標本突變比例為5～20％，低于測序方法的檢測下限，與亞克隆測序的結果相符。98例未經拉米夫定治療的慢性乙肝患者中有5例檢測到耐藥突變，變異比例為10～20％。拉米夫定治療組的拉米夫定耐藥株變異率(22.45％)顯著高于序貫治療組。 實驗結果表明，本研究所建立的拉米夫定耐藥株變異檢測方法快速靈敏，可以用于臨床治療中拉米夫定耐藥變異的監(jiān)測，為臨床治療方案的選