寡核苷酸芯片檢測(cè)乙型肝炎病毒基因突變的應(yīng)用研究.pdf

1、乙型肝炎病毒在自然狀態(tài)或藥物誘導(dǎo)下常出現(xiàn)基因變異情況，越來(lái)越多的研究資料表明，HBV基因序列的變異與異常的血清學(xué)現(xiàn)象、免疫預(yù)防失敗、致病性的改變以及臨床耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。 該課題的研究目的是通過(guò)自行設(shè)計(jì)、制作檢測(cè)乙型肝炎基因突變的寡核苷酸芯片，觀察HBsAg和HBVDNA定量陽(yáng)性的慢性乙型肝炎病人HBV前C區(qū)及BCP區(qū)基因突變情況，探討HBV前C區(qū)及BCP區(qū)基因突變?cè)谝腋尾∏榘l(fā)展、轉(zhuǎn)歸中的作用及基因芯片檢測(cè)方法在此領(lǐng)域的應(yīng)用

2、前景。該課題的研究?jī)?nèi)容主要包括寡核苷酸芯片的設(shè)計(jì)和制作、利用制作的芯片對(duì)慢性乙型肝炎病例的檢測(cè)及結(jié)果分析等內(nèi)容。 首先，根據(jù)Genebank上的HBV基因組序列，利用相關(guān)軟件設(shè)計(jì)、合成了制作芯片的寡核苷酸探針及用于擴(kuò)增目的基因的引物，探針包括針對(duì)HBV序列前C區(qū)1896、1899位核苷酸位點(diǎn)的野生探針和突變探針；針對(duì)BCP區(qū)1762、1764位點(diǎn)的野生探針及雙突變探針。然后對(duì)作為芯片載體的玻片進(jìn)行了醛基化處理，使用全自動(dòng)點(diǎn)樣儀將

3、合成的探針按設(shè)計(jì)的陣列點(diǎn)在處理好的玻片上，點(diǎn)樣后的玻片通過(guò)一系列處理，使靶基因牢固的固定于玻片表面，并阻斷非特異性位點(diǎn)，以提高雜交效率。 選取臨床60例慢性乙型肝炎病人，對(duì)其進(jìn)行各項(xiàng)肝炎指標(biāo)、肝功能和HBVDNA定量測(cè)定的同時(shí)，用自制的基因芯片對(duì)其乙型肝炎病毒前C區(qū)、BCP區(qū)基因突變情況進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定過(guò)程包括：采用酚/氯仿/異戊醇法提取乙肝病毒DNA；用設(shè)計(jì)的引物采用不對(duì)稱(chēng)PCR法擴(kuò)增包括HBV前C區(qū)、BCP區(qū)的目的片段，并同

4、時(shí)用隨機(jī)摻入法對(duì)擴(kuò)增片段用Cy5進(jìn)行熒光標(biāo)記；標(biāo)記好的擴(kuò)增片段與制備好的寡核苷酸芯片進(jìn)行雜交；用激光共聚焦芯片掃描儀對(duì)各雜交點(diǎn)的熒光信號(hào)位置、熒光強(qiáng)弱等大量數(shù)據(jù)信息進(jìn)行采集，IMAGENE3.0分析Cy5熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值進(jìn)行結(jié)果判斷；隨機(jī)選取20例基因芯片陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行了基因序列測(cè)定。結(jié)果顯示：①60例HBsAg和HBVDNA定量陽(yáng)性的慢性乙型肝炎病人基因芯片法檢測(cè)顯示54例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為90.0％，最低檢測(cè)靈敏度為1×104copy

5、/ml；②對(duì)于非混合株感染病例，基因芯片檢測(cè)法與測(cè)序法相比較，符合率為100％，對(duì)于混合株感染病例，二者符合率僅為15.4％，測(cè)序法遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于基因芯片檢測(cè)法；③在54例基因芯片檢測(cè)陽(yáng)性的病例中，HBeAb陽(yáng)性和e系統(tǒng)陰性組與HBeAg陽(yáng)性組比較，HBVDNA定量結(jié)果無(wú)顯著性差異；在BCP區(qū)聯(lián)合突變及前C區(qū)、BCP區(qū)多點(diǎn)突變方面有極顯著性差異(p＜0.01)，在前C區(qū)1896位點(diǎn)突變方面有顯著性差異(p＜0.05)；④54例基因芯片檢測(cè)陽(yáng)性

6、的病例中前C區(qū)1896位突變組及多點(diǎn)突變組與未突變異組相比，ALT、AST、BIL檢測(cè)結(jié)果具有極顯著差異(p＜0.01)，前C區(qū)1899位突變組及BCP區(qū)雙突變組與未變異組相比ALT、AST及BIL檢測(cè)結(jié)果也有顯著差異(p＜0.05)，各變異組間三項(xiàng)指標(biāo)相比較差異無(wú)顯著性；⑤54例基因芯片檢測(cè)陽(yáng)性的病例中，慢性乙型肝炎輕度、中度和重度組前C區(qū)和BCP區(qū)各位點(diǎn)突變率相比較無(wú)顯著性差異。 通過(guò)上述測(cè)定及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出以下結(jié)論：①乙型

7、肝炎病毒前C區(qū)(主要是1896位的終止突變)、BCP區(qū)單點(diǎn)突變和/或多點(diǎn)突變是引起慢性乙型肝炎患者血清e(cuò)抗原轉(zhuǎn)陰的主要原因；②血清e(cuò)抗原轉(zhuǎn)陰并非一定是病情趨于好轉(zhuǎn)的指標(biāo)，e抗原陰性的慢性乙型肝炎患者體內(nèi)HBVDNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄仍處于較高狀態(tài)；③乙型肝炎病毒前C區(qū)、BCP區(qū)基因突變可加劇抗病毒免疫反應(yīng)引起的肝細(xì)胞破壞，導(dǎo)致病情加重；④乙型肝炎病毒前C區(qū)、BCP區(qū)終止密碼變異并不是慢性乙肝患者病情發(fā)展的根本原因，其僅是病毒逃避宿主免疫應(yīng)答的一