西尼羅病毒寡核苷酸基因芯片的初步研究.pdf

1、西尼羅病毒是一種蚊子或蜱螨類傳播的蟲媒病毒，分類學(xué)上屬于黃病毒屬的黃病毒科，為RNA病毒。西尼羅病毒具有致病性高和傳染性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以導(dǎo)致西尼羅熱或西尼羅病毒腦炎，其宿主動(dòng)物和傳播媒介在自然界廣泛存在。該病毒具有跨地區(qū)進(jìn)行世界性廣泛傳播的能力，擴(kuò)大流行的潛在危險(xiǎn)性很大，已經(jīng)引起世界各國(guó)的高度重視。西尼羅病毒的RNA基因組全長(zhǎng)約10962bp，包含一個(gè)編碼十個(gè)病毒蛋白的開(kāi)放閱讀框。編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白(C，E，M)，7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，N

2、S2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。根據(jù)E蛋白基因序列差異，西尼羅病毒分為兩個(gè)病毒株系：株系1病毒能使人致病，分布在北美、歐洲、非洲、亞洲和澳大利亞等地區(qū)；株系2病毒只在非洲部分地區(qū)的動(dòng)物中流行。本課題首先采用長(zhǎng)片段RT-PCR技術(shù)構(gòu)建了西尼羅株系1病毒(GenBank登錄號(hào)：AF196835)的cDNA亞克隆，可用于進(jìn)一步構(gòu)建西尼羅病毒全長(zhǎng)感染性cDNA克隆，以便用于研究西尼羅病毒復(fù)制和病理過(guò)程的分子機(jī)制；其次，制

3、備了西尼羅病毒寡核苷酸基因芯片，為進(jìn)一步研究多病毒聯(lián)合檢測(cè)芯片打下基礎(chǔ)。另外設(shè)計(jì)了寡核苷酸基因芯片的判別程序并將該程序應(yīng)用于西尼羅病毒寡核苷酸基因芯片檢測(cè)結(jié)果的判別分析。 在西尼羅株系1病毒的cDNA亞克隆構(gòu)建過(guò)程中，使用長(zhǎng)片段RT-PCR技術(shù)對(duì)病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄是一個(gè)關(guān)鍵步驟。實(shí)驗(yàn)中對(duì)長(zhǎng)片段RT-PCR條件進(jìn)行了優(yōu)化：第一，使用兩步法的反轉(zhuǎn)錄操作流程；第二，使用AMV和PrimeScriptRTase混合酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。A

4、MV和PrimeScriptRTase在55℃時(shí)仍然具有較高的活性，在優(yōu)化的操作流程中應(yīng)用50℃進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；第三，根據(jù)引物Tm對(duì)退火溫度和延伸溫度進(jìn)行了優(yōu)化，把PCR引物的退火溫度提高到65-67℃。在第二輪的PCR反應(yīng)中又把延伸溫度提高到72℃，大約高于Tm5℃。實(shí)驗(yàn)中共設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，克隆的基因序列包括了西尼羅株系1病毒序列1-3631和8865-11030。設(shè)計(jì)的引物上引入相應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)，通過(guò)這些限制性酶切位點(diǎn)可以將克隆

5、片段連接起來(lái)，這樣為制備西尼羅病毒全長(zhǎng)感染性cDNA克隆做好了準(zhǔn)備。在5’端的引物引入一個(gè)T7啟動(dòng)子位點(diǎn)，可以使用T7RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。所構(gòu)建的cDNA亞克隆包括了病毒的核衣殼蛋白、M蛋白序列、E蛋白序列、非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)、非結(jié)構(gòu)蛋白2A(NS2A)和非結(jié)構(gòu)蛋白5(NS5)的部分序列，可用于研究西尼羅病毒的感染、復(fù)制和病理機(jī)制，也可為基因工程疫苗的研制提供材料。 目前，西尼羅病毒檢測(cè)的傳統(tǒng)方法主要有間接免疫熒光、補(bǔ)

6、體結(jié)合試驗(yàn)、噬菌斑減少中和試驗(yàn)、血細(xì)胞凝集抑制反應(yīng)和病毒分離技術(shù)。這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法一次只能確定或排除一種病毒，不能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模高通量的檢測(cè)，并且人體對(duì)外來(lái)病毒產(chǎn)生免疫有一定的時(shí)滯，因此這些檢測(cè)方法在病毒感染的早期診斷中敏感性很低?；蛐酒夹g(shù)為西尼羅病毒的檢測(cè)提供了一種新的途徑?；蛐酒瑱z測(cè)的對(duì)象是DNA或RNA，只要人體內(nèi)有病毒顆粒就能檢測(cè)，并能同時(shí)對(duì)多種病毒進(jìn)行檢測(cè)，具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。 基因芯片(genechip)又稱DNA芯

7、片，是專門用于核酸檢測(cè)的生物芯片，可分為cDNA芯片和寡核昔酸芯片兩種。本課題制備了用于西尼羅病毒檢測(cè)的寡核苷酸基因芯片。實(shí)驗(yàn)中以西尼羅病毒株NY99為材料，將抽提的RNA逆轉(zhuǎn)錄后使用限制性顯示技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記。針對(duì)西尼羅病毒基因設(shè)計(jì)12條長(zhǎng)度為60mer的寡核苷酸探針，然后將探針固定在氨基化的芯片片基上，通過(guò)樣品與探針的雜交實(shí)驗(yàn)篩選高特異性和高靈敏度的寡核苷酸探針。同時(shí)我們將黃熱病毒、乙腦病毒和登革病毒的樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后使用限制

8、性顯示技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后與西尼羅病毒寡核苷酸基因芯片雜交，用來(lái)檢驗(yàn)探針的特異性。我們使用篩選的探針建立西尼羅病毒寡核苷酸基因芯片系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究多病毒聯(lián)合檢測(cè)芯片打下了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)中還對(duì)芯片檢測(cè)靈敏度與RT-PCR檢測(cè)靈敏度進(jìn)行了對(duì)比研究。將西尼羅病毒的cDNA進(jìn)行101、102、和103倍稀釋，分別進(jìn)行芯片實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：病毒的cDNA原液、101和102倍稀釋液都能夠檢測(cè)出西尼羅病毒樣品，而103倍稀釋液的芯片實(shí)驗(yàn)不能檢測(cè)

9、出西尼羅病毒樣品。病毒的cDNA原液、101、102、和103倍稀釋液的RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：病毒的cDNA原液、101、和102倍稀釋液能夠檢測(cè)出西尼羅病毒樣品，而103倍稀釋液的RT-PCR實(shí)驗(yàn)不能檢測(cè)出西尼羅病毒樣品。對(duì)芯片陽(yáng)性對(duì)照探針的數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無(wú)顯著性意義，說(shuō)明質(zhì)控系統(tǒng)穩(wěn)定。芯片實(shí)驗(yàn)與RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比說(shuō)明病毒檢測(cè)芯片的靈敏度與普通RT-PCR方法相當(dāng)。 檢測(cè)芯片制備的過(guò)程中，存在多種因素影響

10、檢測(cè)結(jié)果的判別。如芯片類型、樣品的標(biāo)記方法以及掃描設(shè)備和軟件等。芯片的檢測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)掃描提取出來(lái)以后，需根據(jù)數(shù)據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行快速準(zhǔn)確的判別，而檢測(cè)芯片的規(guī)格和待測(cè)的樣品各不相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判別標(biāo)準(zhǔn)也不是一成不變的。通常，檢測(cè)芯片的結(jié)果主要由專業(yè)人員使用統(tǒng)計(jì)軟件或者手工計(jì)算進(jìn)行人工判別，人工判別效率低并可能存在錯(cuò)誤判別。因此，自動(dòng)化、高效率的判別程序的開(kāi)發(fā)將加快檢測(cè)芯片的推廣應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)使用VisualBasic6.0初步設(shè)計(jì)了檢測(cè)芯片的

11、判別程序，設(shè)計(jì)的判別程序可以識(shí)別芯片掃描儀輸出的數(shù)據(jù)文件，并可根據(jù)數(shù)據(jù)文件內(nèi)的字段對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)選定。然后按照不同實(shí)驗(yàn)的需要針對(duì)相應(yīng)的字段設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)和閾值，根據(jù)這些篩選標(biāo)準(zhǔn)和閾值實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)芯片的判別。判別程序可以查詢并注釋數(shù)據(jù)，包括生物芯片的相關(guān)信息及探針的生物學(xué)信息。判別程序完成分析后，會(huì)列出一個(gè)詳細(xì)的判別結(jié)果，包括檢測(cè)芯片中的各個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果、參考值的范圍等。因此，通過(guò)判別程序?qū)π酒瑨呙钄?shù)據(jù)的分析、抽提和判別，初步實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)芯片

12、結(jié)果的判別分析自動(dòng)化。為開(kāi)發(fā)高效、自動(dòng)化的判別軟件打下了基礎(chǔ)。 綜上所述，本研究采用長(zhǎng)片段RT-PCR技術(shù)構(gòu)建了西尼羅株系1病毒的cDNA亞克??；使用寡核苷酸探針制備了西尼羅病毒基因芯片，并進(jìn)行了檢測(cè)芯片靈敏度的實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證；設(shè)計(jì)了檢測(cè)芯片的判別程序，為實(shí)現(xiàn)檢測(cè)芯片結(jié)果的自動(dòng)化判別打下了基礎(chǔ)。結(jié)果證實(shí)，研制的西尼羅病毒基因芯片可成功用于西尼羅病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。針對(duì)檢測(cè)芯片設(shè)計(jì)的判別程序可實(shí)現(xiàn)芯片數(shù)據(jù)的自動(dòng)化判別分析，進(jìn)而將芯片掃描