用于診斷四種豬疫病病毒寡核苷酸芯片的研制.pdf

1、高發(fā)性呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)及免疫系統(tǒng)主要病毒性病原的混合感染和持續(xù)感染，使得集約化養(yǎng)豬業(yè)疫病流行狀況呈現(xiàn)高度復(fù)雜化、多樣化趨勢(shì)，進(jìn)而增加了臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷難度。目前，對(duì)豬疫病病毒性病原的診斷仍采用傳統(tǒng)的病原分離和免疫血清學(xué)方法，其操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力且靈敏度不高。分子生物學(xué)診斷方法如：PCR、標(biāo)記探針雜交等技術(shù)的應(yīng)用，雖然具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但其假陽(yáng)性率較高且一次僅能檢測(cè)一種或同時(shí)檢測(cè)兩三種病毒。基于上述技術(shù)的缺點(diǎn)，本

2、研究應(yīng)用寡核苷酸芯片技術(shù)，結(jié)合不對(duì)稱(chēng)PCR和間接熒光標(biāo)記技術(shù)，制備一款低密度豬疫病病原診斷基因芯片，以滿足目前集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)中流行性病疫原快速、準(zhǔn)確、高通量的檢疫要求。 本研究確定集約化養(yǎng)豬業(yè)常見(jiàn)的4種豬疫病病毒：豬流感病毒、豬偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬藍(lán)耳病毒作為檢測(cè)對(duì)象。根據(jù)四種不同病毒的保守區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增短片斷(100-300 bp)PCR產(chǎn)物的特異性引物。依據(jù)每種短片斷PCR產(chǎn)物序列，篩選出四條高度特異、長(zhǎng)度相同、Tm值和

3、G+C％含量接近的檢測(cè)探針，并將其固定在氨基化修飾的片基上，制備成低密度60-mer寡核苷酸診斷芯片。通過(guò)標(biāo)記樣本與檢測(cè)探針在固液相體系中雜交，一次試驗(yàn)可完成對(duì)這四種豬疫病病毒的診斷。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)芯片上探針點(diǎn)樣濃度的選擇，每種病毒選擇正義鏈或是反義鏈探針作為檢測(cè)探針以及雜交條件等實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行探索和優(yōu)化。以上述四種豬疫病病毒為檢測(cè)模型，對(duì)經(jīng)過(guò)優(yōu)化的豬疫病病毒診斷基因芯片集成系統(tǒng)的靈敏度和特異性進(jìn)行評(píng)估和鑒定。 通過(guò)一系列試驗(yàn)，

4、本研究取得如下的成果：(1)制作出背景低、固定效率高的豬重要病毒性疫病原多重檢測(cè)的基因芯片；(2)通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定了芯片上探針點(diǎn)樣濃度的最佳濃度為25μM； (3)不對(duì)稱(chēng)PCR體系中通過(guò)變換上下游引物作為限制性引物，雜交后結(jié)果進(jìn)行比較，最終確定豬流感病毒、豬偽狂犬病毒及口蹄疫病毒以反義鏈探針作為檢測(cè)探針，而豬藍(lán)耳病毒則以正義鏈探針作為檢測(cè)探針； (4)通過(guò)用間接熒光標(biāo)記技術(shù)引入熒光基團(tuán)，在雜交溫度為60℃，雜交時(shí)間為10h的條件下，能