豬三種重要病毒寡核苷酸芯片診斷方法的建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒Ⅱ(PCV-2)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬瘟病毒(CSFV)是引發(fā)豬疫病的常見(jiàn)病原，且在臨床上常呈混合感染出現(xiàn)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。建立快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測(cè)方法是有效預(yù)防和控制相關(guān)疫病的關(guān)鍵。目前對(duì)這3種病毒的診斷多采用病原分離及各種常規(guī)的血清學(xué)方法進(jìn)行，其操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力且靈敏度較差。分子生物學(xué)方面，雖然已有PCR技術(shù)應(yīng)用于病毒檢測(cè)，但對(duì)不同病毒需分別進(jìn)行診斷，且非特異產(chǎn)物的增多也容易導(dǎo)致臨床誤診。

2、 本研究旨在建立一種基于寡核苷酸芯片技術(shù)的可同時(shí)、快速、高通量檢測(cè)引發(fā)豬疫病常見(jiàn)病原的方法。首先，應(yīng)用生物信息學(xué)方法，針對(duì)病毒基因組保守序列設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的60-mer寡核苷酸探針，并固定于經(jīng)氨基化修飾的片基上，制備出寡核苷酸芯片。然后針對(duì)三種病原分別設(shè)計(jì)出相應(yīng)的引物，對(duì)樣本進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)PeR 擴(kuò)增，產(chǎn)生大量可與寡核苷酸探針特異性互補(bǔ)的單鏈DNA，并通過(guò)間接熒光標(biāo)記技術(shù)使其標(biāo)記上熒光物質(zhì)。將標(biāo)有熒光物質(zhì)的擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片雜交，通過(guò)芯片掃描、

3、分析熒光信號(hào)從而達(dá)到對(duì)病原檢測(cè)的目的。在研究過(guò)程中，對(duì)樣本處理、不對(duì)稱(chēng)PCR操作及雜交條件等過(guò)程進(jìn)行探索和優(yōu)化。以上述三種病毒為檢測(cè)模型，對(duì)寡核苷酸芯片技術(shù)平臺(tái)體系的靈敏度和特異性進(jìn)行評(píng)估和鑒定。 通過(guò)試驗(yàn)，本研究獲得了以下成果：(1)制作出背景低，特異性高的寡核苷酸芯片；(2)通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定了不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增的條件；(3)通過(guò)間接熒光標(biāo)記技術(shù)引入報(bào)告基團(tuán)，在雜交溫度為60℃，雜交時(shí)間為12h的條件下，能夠得到強(qiáng)而穩(wěn)定的熒光

4、信號(hào)；(4)由掃描結(jié)果可以看出三種病毒樣本均可在相應(yīng)的探針位置處呈現(xiàn)出陽(yáng)性熒光信號(hào)，而陰性對(duì)照和空白對(duì)照則基本檢測(cè)不到熒光信號(hào)，并且各個(gè)病毒之間也不存在交叉雜交現(xiàn)象；(5)應(yīng)用該技術(shù)平臺(tái)可檢測(cè)到少至10個(gè)拷貝的PCV2、PPV基因和100個(gè)拷貝的CSFV基因。 研究表明，我們所建立的寡核苷酸芯片檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)、并具有高通量、快速檢測(cè)多種病原的優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)的完成和應(yīng)用將可大大完善我國(guó)對(duì)疫病診斷的