蓖麻毒素寡核苷酸適配子篩選方法的比較研究.pdf

1、蓖麻毒素蛋白來(lái)源于蓖麻籽中，由A、B兩條肽鏈通過(guò)二硫鍵連接而成。其中，A鏈為效應(yīng)鏈，具有糖苷酶活性，能使核糖體失活；B鏈為結(jié)合鏈，含有兩個(gè)半乳糖結(jié)合位點(diǎn)。其毒性作用機(jī)理主要是抑制蛋白質(zhì)合成。 指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)，也稱(chēng)之為體外篩選。通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)能夠從龐大的核酸文庫(kù)中篩選獲得與靶分子具有高親和力、高特異性結(jié)合的寡核苷酸適配子。由于寡核苷酸適配子結(jié)合的靶物質(zhì)范圍廣，包括小分子、多肽、蛋白和細(xì)胞等，而且與靶分子結(jié)合的親

2、和力高、特異性強(qiáng)，所以SELEX技術(shù)在基礎(chǔ)研究、藥物篩選以及臨床診斷等方面顯示了廣闊的應(yīng)用前景。本研究的目的是借助SELEX技術(shù)從隨機(jī)ssDNA文庫(kù)中篩選獲得特異識(shí)別蓖麻毒素蛋白的寡核苷酸適配子，為開(kāi)展對(duì)蓖麻毒素生物傳感器研究和阻斷劑研究奠定了基礎(chǔ)。全文分為兩部分： 一、構(gòu)建了含40個(gè)隨機(jī)序列全長(zhǎng)87nt的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)，采用微孔法和親和樹(shù)脂層析法兩種傳統(tǒng)的SELEX篩選方法對(duì)蓖麻毒素進(jìn)行篩選。隨機(jī)挑選的22條適配子的一級(jí)序

3、列可分為6個(gè)家族，模擬的二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在莖環(huán)、凸環(huán)結(jié)構(gòu)，這可能是與靶蛋白作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。親和力測(cè)定結(jié)果顯示，適配子A3的親和力最高，Kd值為105nM。 二、將高效毛細(xì)管電泳技術(shù)作為分離手段引入到對(duì)蓖麻毒素蛋白的SELEX篩選中，建立了全新的高效、快速的CE-SELEX篩選平臺(tái)。硝酸纖維膜結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，僅經(jīng)CE-SELEX兩輪篩選后富集文庫(kù)與蓖麻毒素靶蛋白的結(jié)合率就上升至60.2％，而四輪篩選之后高達(dá)87.2％。隨機(jī)挑選的11

4、條寡核苷酸適配子根據(jù)序列同源性分析的結(jié)果分為3個(gè)家族，其中兩條序列C1、C5與蓖麻毒素的親和力較高，Kd值分別是80nM和58nM。此外，還發(fā)現(xiàn)通過(guò)CE-SELEX得到的適配子C1、C5與傳統(tǒng)方法得到的A3序列具有非常高的同源性。隨后的適配子酶聯(lián)實(shí)驗(yàn)和點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明這3條寡核苷酸適配子不僅與靶蛋白的親和力高，而且其具有高的特異選擇性。這些特異識(shí)別蓖麻毒素蛋白的寡核苷酸適配子可以被用作生物傳感器的識(shí)別元件，為今后實(shí)現(xiàn)蓖麻毒素的生物傳