一種寡核苷酸介導(dǎo)的大腸桿菌基因敲除或點(diǎn)突變的方法.pdf

1、重組工程(Red/ET,recombination mediated genetic engineering)是指由重組酶催化的DNA片段之間的同源重組而在大腸桿菌中進(jìn)行基因克隆或DNA改造的一種基因工程技術(shù)。重組工程在常規(guī)基因克隆方法難以進(jìn)行或效率極低(如待克隆或修飾的DNA片段過大、合適的酶切位點(diǎn)難以尋找、凝膠回收難以進(jìn)行等等,此時(shí)常規(guī)基因克隆方法難以進(jìn)行或效率極低)時(shí)有著極大的優(yōu)勢。而且PCR擴(kuò)增也可能引入錯(cuò)配堿基、DNA片段經(jīng)紫

2、外線照射等操作也可能發(fā)生基因突變。重組工程則避免了這些煩瑣操作步驟,可實(shí)現(xiàn)高效的基因克隆和修飾,已逐漸成為常規(guī)的克隆手段。
　　 重組工程中的重組酶主要是來源自λ噬菌體三個(gè)基因,其中exo(Redα)編碼DNA5’端至3’端的外切酶Exo,其作用于雙鏈DNA分子而產(chǎn)生3’端突出的分子；bet(Redβ)編碼單鏈結(jié)合蛋白,其結(jié)合在由Exo作用而形成的DNA分子的3’突出端,同時(shí)還行使重組酶活性,即促進(jìn)兩個(gè)單鏈、同源DNA分子之間的

3、退火；Gam基因編碼的Gam蛋白的作用是抑制大腸桿菌RecBCD對外源DNA的降解,這三個(gè)基因也就是通常意義上的重組酶基因。recA基因可增加重組的效率。
　　 由于重組工程可以短至36個(gè)堿基對的同源區(qū)域之間實(shí)現(xiàn)同源重組,就使得轉(zhuǎn)化線性雙鏈DNA至大腸桿菌而對其基因進(jìn)行修飾成為可能。此線性雙鏈DNA而通過一步的PCR手段而一步獲得。
　　 本論文提供了一種通過寡核苷酸介導(dǎo)的重組工程手段來實(shí)現(xiàn)大腸桿菌的基因敲除和基因點(diǎn)突變

4、的方法。首先是通過重組工程將含有同源臂的蔗糖6-果糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)和卡那霉素抗性基因(neo)的基因盒整合至待修飾的基因,含同源臂的sacB-neo基因盒由PCR獲得。再將含同源臂的寡核苷酸通過重組工程與基因組上的同源序列進(jìn)行同源重組而將蔗糖6-果糖轉(zhuǎn)移酶基因和卡那霉素抗性基因去除,從而實(shí)現(xiàn)無任何堿基冗余的基因敲除和點(diǎn)突變?；蚯贸墓押塑账嵩O(shè)計(jì)與靶基因兩側(cè)的堿基序列一致,點(diǎn)突變的寡核苷酸則在寡核苷酸中引入需要突變的堿基。