一種與微系統(tǒng)兼容的大腸桿菌活細(xì)胞檢測(cè)方法研究.pdf

1、通常來講，大量的病原微生物活躍在包括空氣、水源、土壤以及食物等人們?nèi)粘Ｉ瞽h(huán)境中。為了更好的維護(hù)公眾健康，快速而準(zhǔn)確的環(huán)境評(píng)估就顯得十分必要，尤其是針對(duì)致病菌等微生物的活性檢測(cè)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)情況下只有活的菌體才會(huì)對(duì)人類產(chǎn)生威脅。然而在實(shí)際操作中，檢測(cè)速度與輕便性卻是在開發(fā)及時(shí)有效的細(xì)菌活性檢測(cè)方法過程中不得不面對(duì)的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的病原微生物活性檢測(cè)依賴于以細(xì)菌培養(yǎng)為基礎(chǔ)的分析手段，但這樣的方法通常都比較耗費(fèi)時(shí)間，同時(shí)還必須依賴于實(shí)驗(yàn)室特有的設(shè)

2、備，難以達(dá)到便攜化現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)的要求。而近些年隨著微器件加工技術(shù)的飛速發(fā)展，已經(jīng)有越來越多的生物分析過程可以成功地在微型分析系統(tǒng)(芯片實(shí)驗(yàn)室labonachip或微全分析系統(tǒng)micrototalanalysissystem，μTAS)上演示。以微型化的形式進(jìn)行生物檢測(cè)有著很多優(yōu)越性，例如較小的樣本體積與較少的試劑消耗。除此之外，其在一微小器件上集成多種操作模塊的能力以及隨之而來帶給開發(fā)真正意義上便攜式分析設(shè)備的希望，使得很多研究者都投身到這

3、一領(lǐng)域中來。然而目前為止，對(duì)于如何在微型分析系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)進(jìn)行微生物活性檢測(cè)的方法研究還很有限。 本文著重研究一種具有微系統(tǒng)兼容性的對(duì)活性大腸桿菌進(jìn)行快速檢測(cè)的方法，以期應(yīng)用于食物與水體等的質(zhì)量監(jiān)控。在這一方法中，大腸桿菌熱激蛋白(heatshockprotein，hsp)GroEL的mRNA被用作細(xì)胞活性的標(biāo)志物，通過檢測(cè)這種物質(zhì)的存在已否來判斷細(xì)胞活性。整個(gè)策略從對(duì)大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行可控的高溫?zé)峒ら_始(47℃，20分鐘)，在這一過

4、程中標(biāo)志物GroELmRNA被轉(zhuǎn)錄。之后，引入能與指示物mRNA特異性配對(duì)的5'端生物素標(biāo)記的捕獲探針與目標(biāo)mRNA分子雜交，再加入親和素修飾的磁性顆粒與捕獲探針進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，這樣細(xì)胞活性的標(biāo)志物GroELmRNA就可以通過外加磁場(chǎng)與其他細(xì)胞雜質(zhì)分離。 最后，在經(jīng)過RT-PCR(reverse-transcriptionpolymerasechainreaction)對(duì)標(biāo)志物的放大后，最終信號(hào)的定量分析采用傳統(tǒng)的凝膠電泳或基于A

5、g/Au電化學(xué)反應(yīng)的方法來檢測(cè)。 在研究GroELmRNA對(duì)細(xì)胞活性的表征特性中發(fā)現(xiàn)，熱激溫度與持續(xù)時(shí)間等條件對(duì)標(biāo)志物mRNA的轉(zhuǎn)錄水平有著很大影響；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)熱激過程后一旦環(huán)境溫度回到室溫狀態(tài)下，目標(biāo)mRNA會(huì)在幾分鐘內(nèi)自行降解。在mRNA磁性分離的過程中，對(duì)分離的特異性、可重復(fù)性以及DNA污染等問題也分別進(jìn)行了研究。最后，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了基于Ag/Au電化學(xué)反應(yīng)的分析方法具有比常規(guī)凝膠電泳更為靈敏的檢測(cè)范圍并可區(qū)別出菌體濃度達(dá)到1