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文檔簡介
1、產腸毒素性大腸桿菌(ETEC)作為最主要的腸道病原菌,常引起犢牛、羔羊、仔豬等幼畜腹瀉,在世界大部分地區(qū)廣泛流行,具有高發(fā)病率和死亡率,給畜牧業(yè)帶來嚴重的損失,因此建立一種快速、簡便、靈敏、特異的診斷技術對防治該病具有重要意義。ETEC可在菌毛黏附素協(xié)助下定植在腸道內,繼而產生腸毒素,引起幼畜腹瀉。許多ETEC菌株帶有菌毛黏附素,如K88、K99、987p和F41,因此,通過快速檢測菌毛黏附素,可為ETEC的檢測提供重要的參考依據。
2、r> 本研究旨在通過提取ETEC菌毛K88ab、K99、987p和F41,免疫新西蘭白兔制備單因子血清;以彩色二氧化硅微球(CSN)為載體,將單因子血清修飾到微球表面,制備免疫彩色二氧化硅微球(ICSN),建立一種新型間接凝集技術用于K88ab、K99、987p和F41菌毛的快速檢測。
單因子血清的制備。分別提取四種菌毛,免疫新西蘭白兔,每隔21d免疫一次,共免疫3次;無菌采集兔心血制備抗血清,玻片凝集試驗結果顯示,抗K88
3、ab、K99、987p和F41血清凝集價分別為1∶256、1∶512、1∶128和1∶4096。交叉凝集試驗結果顯示,K88ab抗血清與K99抗原凝集價為1∶32, K99、987p和F41抗血清均與K88抗原交叉凝集,凝集價分別為1∶8、1∶16和1∶16。通過反應條件優(yōu)化,最終確定將抗血清和與之有交叉凝集的菌體壓積1∶1混合,4℃48h吸收交叉抗體。結果顯示,吸收后的抗K88ab、K99、987p和F41血清只與自身抗原發(fā)生凝集反應
4、,特異性良好,凝集價分別為1∶64、1∶256、1∶32和1∶2048。
ICSN的制備及應用。用反相微乳液法制備的CSN與單因子血清結合制備了不同顏色的K88ab、K99、987p和F41 ICSN,同時使用三種不同顏色的ICSN檢測抗原,結果顯示顏色對凝集效果沒有影響。通過反應條件優(yōu)化,最終確定玻片凝集試驗的反應體系和反應條件為:ICSN20μL、菌液20μL(菌液濃度范圍為106~109CFU·mL-1),25℃~37℃
5、反應1 min。特異性實驗結果顯示,K88ab、K99、987p和F41 ICSN與ETEC C83903(K88ab+)、C82529(K99+)、C83915(987p+)、O142(F41+)、大腸桿菌DN69-A、大腸桿菌DN89-B、綠膿桿菌(SD004)、豬丹毒桿菌(CVCC124)、豬霍亂沙門氏菌(CVCC503)、巴氏桿菌(CVCC430)、生理鹽水不發(fā)生交叉凝集反應。敏感性實驗結果顯示,K88ab、K99、987p和F
6、41 ICSN對菌液的最小檢出濃度為1.0~5.1×106CFU·mL-1。制備的ICSN在4℃保存30 d,其特異性、敏感性沒有明顯變化,具有良好的穩(wěn)定性。對雙盲樣品的檢測結果同實際樣品的檢測結果,100%符合。新型凝集試驗結果直觀、易于判斷,且每次使用的抗體量為玻片凝集試驗的1/500,適用于抗體量少而檢測樣品多的情況。
本研究建立了一種以CSN為載體,用于檢測ETEC K88ab、K99、987p、F41菌毛的新型間接凝
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