表達(dá)外源基因的雞源大腸桿菌1型菌毛載體的初步構(gòu)建.pdf

1、本研究通過PCR的方法對所分離的101株雞源大腸桿菌進(jìn)行1型菌毛蛋白結(jié)構(gòu)基因的檢測，從而鑒定出63株具有1型菌毛的大腸桿菌。 通過對1型菌毛主要亞單位蛋白FimA的二級結(jié)構(gòu)、親疏水性、抗原表位、柔韌性等的預(yù)測分析，預(yù)測在68和69位氨基酸殘基之間(命名為F插入位點)插入外源抗原表位時，可使1型菌毛的表達(dá)與裝配不受影響。構(gòu)建同源重組自殺載體，首先選擇插入位點F上下游區(qū)域的一段序列作為同源重組指導(dǎo)序列，然后采用重疊延伸PCR方法在插

2、入位點F處定點突變引入KpnI酶切位點。對本實驗室擴(kuò)增保存的新城疫La Sota系HN基因所編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)、抗原表位進(jìn)行預(yù)測分析，由于菌毛適合短的線性表位的呈現(xiàn)，因此選定包含抗原表位的一個小的基因片段HNS作為外源抗原表位，通過PCR擴(kuò)增得到基因片段HNS并插入F插入位點中，得到插入突變片段fimALR-HNS，將其整合入攜帶氯霉素抗性基因和sacB基因的自殺質(zhì)粒pDM4中，以氯霉素抗性基因作為單交換負(fù)篩選標(biāo)記，以sacB基因作為雙