大腸桿菌中人源胰蛋白酶-1的融合表達(dá).pdf

1、胰蛋白酶是絲氨酸蛋白酶家族的重要成員,是許多生物技術(shù)領(lǐng)域的工具酶,在工業(yè)生產(chǎn)胰島素的過程中,胰島素原的體外激活也需要胰蛋白酶。從動(dòng)物(豬、牛等)的胰腺中提取的胰蛋白酶由于可能會(huì)有一些致病物質(zhì)的殘留,限制了其在食品和藥品領(lǐng)域的應(yīng)用,目前急需重組胰蛋白酶的生產(chǎn)。本文旨在探討人源胰蛋白酶-1在原核生物中的表達(dá),為其工業(yè)化生產(chǎn)及其應(yīng)用提供研究策略。
　　本文首先根據(jù)Codonusage網(wǎng)站提供的E.coli密碼子使用頻率表對(duì)人源胰蛋白酶-

2、1的核酸序列進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì),將全基因合成的人源trypsin-1核酸序列插入載體pET-39b(+)中凝血酶識(shí)別位點(diǎn)編碼序列的下游,成功構(gòu)建了重組載體pET-39b-trypsin-1,并在細(xì)菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了融合蛋白DsbA-trypsin的大量表達(dá)。融合蛋白主要以包涵體的形式存在,通過對(duì)包涵體蛋白胞外變性、稀釋復(fù)性和凝血酶激活操作,獲得了有活性的人源trypsin-1。并對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,在最優(yōu)誘導(dǎo)條件:37℃,220r

3、pm,500ml搖瓶裝液量為100ml的培養(yǎng)下,以0.5mmol-L-1的誘導(dǎo)濃度,誘導(dǎo)10h后,目的融合蛋白的表達(dá)量最高。以市售的豬胰蛋白酶為參照,相當(dāng)于每升發(fā)酵液獲得了約1.6mg有活性的胰蛋白酶。為胰蛋白酶的原核表達(dá)提供一定的借鑒。
　　通過重疊延伸PCR將來自載體pET-39b(+)的無信號(hào)肽的DsbA中的Cys突變?yōu)镾er,并構(gòu)建了linker-DsbAmut-linker序列?；谳d體pET-39b-trypsin-1

4、與pET-28a(+),成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒p28-Dmut-trypsin。20℃條件下,在工程菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了重組質(zhì)粒p28-Dmut-trypsin的可溶性誘導(dǎo)表達(dá),可溶性重組蛋白約占總表達(dá)融合蛋白的40％。通過Ni親和層析純化和腸激酶的切割,獲得了有活性的人源胰蛋白酶-1。在誘導(dǎo)條件:20℃,220rpm,500ml搖瓶裝液量為100ml,0.5mmol-L-1IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8h后,以市售的豬胰蛋白酶為參照,相當(dāng)于每