EGF-IL-18融合蛋白在大腸桿菌的表達(dá)純化及復(fù)性研究.pdf

1、目的： 構(gòu)建EGF-IL—18融合基因的原核表達(dá)載體，分離純化有活性的EGF-IL一18融合蛋白，為進(jìn)一步研究其體外和動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.EGF-IL-18融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)采用PCR方法，以質(zhì)粒pFUS-EGF-IL一18為模板，擴(kuò)增EGF-IL．18融合基因，并將其分別亞克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pETl2a(+)、pET32a(+)，構(gòu)建二種表達(dá)載體pETl2a(+)一EGF-

2、IL一18、pET32a(+)一EGF-IL-18，限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切和測(cè)序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。將二種表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EcoliRosetta(DE3)，IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)，SDS-PAGE和免疫印跡分析表達(dá)產(chǎn)物。 2．表達(dá)上清中的EGF-IL-18融合蛋白的純化以Ni-NTA親和層析和陰離子交換柱層析DEAE-52二步法純化表達(dá)上清中的EGF—IL一18融合蛋白。純化產(chǎn)物經(jīng)腸激酶酶切切除TrxA標(biāo)簽，進(jìn)一步經(jīng)Ni-NTA親和層析

3、純化獲得天然N端的EGF-IL一18融合蛋白。SDS-PAGE和免疫印跡分析純化產(chǎn)物。 3．EGF-IL-18融合蛋白包涵體的復(fù)性及純化大量表達(dá)分離EGF-IL一18融合蛋白包涵體，并用2M尿素和1％TritonX-100反復(fù)洗滌。以8M尿素溶解包涵體，將包涵體裂解液上樣于弱陰離子交換柱DEAE-52，進(jìn)行柱上復(fù)柱，復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)一步用分子篩SephadexG-75純化。復(fù)性純化產(chǎn)物與人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)共培養(yǎng)24h，RT

4、-PCR檢測(cè)PBMCIFN-?mRNA的表達(dá)情況來(lái)評(píng)價(jià)復(fù)性效果。 4．體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EGF-IL-18融合蛋白的初步生物學(xué)活性將純化的EGF-IL-18融合蛋白作用于人單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞(KG一1)，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-?的分泌水平來(lái)初步評(píng)價(jià)EGF-IL-18融合蛋白生物學(xué)活性。 結(jié)果： 1.原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)雙酶切分析以及測(cè)序結(jié)果表明原核表達(dá)載體pETl2a(+)．EGF-IL．18、pET

5、32a(+)一EGF-IL-18與設(shè)計(jì)相符；工程菌E.coliRosetta(DE3)/pETl2a(+)一EGF-IL-18誘導(dǎo)表達(dá)后在分子量為25kDa處可產(chǎn)生特異的表達(dá)條帶，并能夠被抗人IL一18單克隆抗體所識(shí)別。工程菌E.coliRosetta(DE3)/pET32a(+)一EGF-IL一18誘導(dǎo)表達(dá)后在分子量為37kDa處可產(chǎn)生特異的表達(dá)條帶，并能夠被抗人IL—18單克隆抗體所識(shí)別，與預(yù)期一致。 2．表達(dá)上清中的EGF

6、-IL-18融合蛋白的純化EGF-IL一18融合蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析柱和陰離子交換層析柱DEAE-52二步法純化后純度達(dá)95％。腸激酶酶切EGF-IL一18融合蛋白可產(chǎn)生分子量為為16．7kDa和21kDa的兩個(gè)蛋白，與預(yù)期一致。免疫印跡分析證實(shí)腸激酶酶切、純化后的EGF-IL．18融合蛋白能夠被抗人IL一18單克隆抗體所識(shí)別。 3．EGF-IL-18融合蛋白包涵體的復(fù)性及純化變性的EGF-IL一18融合蛋白包涵體經(jīng)陰離子

7、交換層析柱DEAE-52柱上復(fù)性和分子篩SephadexG-75進(jìn)一步純化后純度達(dá)95％。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明復(fù)性產(chǎn)物具有誘導(dǎo)人PBMCIFN-T基因表達(dá)的能力。 4．體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EGF-IL-18融合蛋白的初步生物學(xué)活性IFN-7ELISA結(jié)果顯示，EGF-IL一18融合蛋白具有明顯地誘導(dǎo)KG一1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-7的能力，但活性低于標(biāo)準(zhǔn)MetIL一18。 結(jié)論： 我們成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pETl2a(+)一