大腸桿菌DNA結(jié)合蛋白克隆表達(dá)純化及體外自組裝功能研究.pdf

1、DNA結(jié)合蛋白(DNA-binding protein from starved cells,Dps)是存在于古生菌及細(xì)菌中的一類抗壓力蛋白,屬于鐵蛋白超家族。它既能通過(guò)亞鐵氧化酶活性結(jié)合鐵離子對(duì)氧化壓力做出應(yīng)答,又能在氧化并儲(chǔ)存鐵的同時(shí)去除了H2O2與Fe(Ⅱ)的毒性,從而保護(hù)DNA、蛋白及膜脂免受自由基損傷。另外,在鐵、銅、輻射、高鹽、酸、堿、饑餓或營(yíng)養(yǎng)不足等脅迫時(shí),一些細(xì)菌的Dps蛋白還能非特異性結(jié)合DNA,形成一個(gè)高度有序且穩(wěn)定

2、的Dps-DNA復(fù)合體,使得染色體從松散易受損傷形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟o實(shí)狀態(tài),從而保護(hù)DNA免受各種因素的損傷。Dps蛋白能夠通過(guò)自組裝機(jī)制成十二聚體發(fā)揮相關(guān)功能,但自組裝過(guò)程的機(jī)制與條件尚不明確。因此研究Dps蛋白的自組裝機(jī)制,找到其聚合與解聚條件,有助于深層次揭示其蛋白功能,并在生物納米技術(shù)以及免疫治療方面發(fā)展其可能的應(yīng)用。
　　本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌(Eschericha coli, E.coli)基因組為模板,對(duì)其Dps蛋白基因進(jìn)行克

3、隆,并在其下游引入His Tag,重組到pBV220載體上成功構(gòu)建pBV-Dps-6His原核表達(dá)載體,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建出兩個(gè) Dps突變表達(dá)載體 pBV-Dps-2X-6His原核表達(dá)載體及 pBV-Dps-Ua-Ub-6His原核表達(dá)載體;pBV-Dps-2X-6His是在 Dps-6His的Y107和P108之間插入5個(gè)氨基酸序列,而pBV-Dps-Ua-Ub-6His是在Dps的Y107和P108之間插入編碼幽門螺桿菌(Helic

4、obacter pylori, HP)尿素酶多表位抗原(Ua-Ub)的47個(gè)氨基酸序列;經(jīng)42℃誘導(dǎo),Dps-6His、Dps-2X-6His、Dps-Ua-Ub-6His蛋白在原核表達(dá)細(xì)胞(DH5α菌株)以包涵體形式高效表達(dá);利用親和層析純化三種蛋白并經(jīng)過(guò)Western Blotting鑒定;體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Dps-6His蛋白能自組裝形成十二聚體且該過(guò)程受 Na+、Mg2+、SDS等因素的影響;Dps-2X-6His以及 Dps-

5、Ua-Ub-6His蛋白聚合能力差,易解聚,說(shuō)明插入外源序列的Dps突變體對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和自組裝功能影響較大;Dps-6His蛋白能與DNA非特異性結(jié)合,并初步推測(cè)這種結(jié)合依賴于Dps十二聚體蛋白的濃度;Dps-6His蛋白能保護(hù)質(zhì)粒DNA免受自由基造成的氧化損傷,而且微量蛋白就具有高效的保護(hù)作用;納米銀(Nanosilver particle, Np-Ag)也對(duì)Dps-6His蛋白有吸附作用,該作用可能與蛋白的結(jié)構(gòu)有關(guān),Np-Ag對(duì)天然的