BDNF-TAT融合蛋白在大腸桿菌中的表達純化及體外活性測定.pdf

1、神經退行性疾病,如老年性癡呆(Alzheimer's disease AD)、帕金森氏癥(Parkinson's disease PD)、萎縮性側索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、和亨廷頓氏病(Huntington's disease HD)等,臨床表現(xiàn)為肢體運動和學習記憶等功能障礙,主要原因是神經元功能的缺失或死亡。目前沒有理想的治療手段,在我國AD和PD這兩種疾病已經累及大約1000萬人,

2、給個人家庭和社會帶來沉重負擔[1]。研究表明,神經營養(yǎng)因子家族成員(neurotrophic factors,NTFs)等,顯示了很好的中樞神經系統(tǒng)神經退行性疾病的治療前景[2]。腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)是神經營養(yǎng)因子家族成員包括之一,與其特異性受體酪氨酸激酶家族成員trkB結合,激活下游的信號傳導途徑,而發(fā)揮神經營養(yǎng)生物活性[3]。
　　 然而,血腦屏障(BBB)阻礙了大分子藥物從血液中進入大腦發(fā)揮生理作用,人大腦血腦屏

3、障(BBB)由血管內皮細胞緊密連接組成,BBB腔內面為血液,腔外面多為外膜細胞,星行細胞及少量的神經元。天然BDNF不能透過BBB進入大腦發(fā)揮神經營養(yǎng)活性[5]。
　　 蛋白質轉導結構域(protein transduction domain,PTD),如來源于人類Ⅰ型免疫缺陷病毒的轉錄激活蛋白(Trans-activator transcription,TAT)的PTD,是一類富含正電荷能夠將與其物理或化學連接的化合物、蛋白質

4、、或核酸類分子,帶過細胞膜進入細胞漿,胞核內,甚至BBB,發(fā)揮各自的生物學功能的結構域。PTD/TKT介導的蛋白質可穿過由腦血管內皮細胞組成的BBB,使所攜帶蛋白進入大腦發(fā)揮生理作用,而使一些在正常情況下是不能通過BBB的蛋白進入腦組織。
　　 本實驗中心前期通過基因工程的方法成功制備了編碼成熟BDNF-TAT融合蛋白的基因,目的在于在世界上首先制備一種能通過BBB進入中樞神經系統(tǒng),治療神經退行性疾病的基因重組神經營養(yǎng)因子藥物制

5、劑。
　　 基于前期研究,本文采用重組質粒PET-30(a)-BDNF-TAT轉化至大腸桿菌BL21(DE3)plysS中優(yōu)化表達,經陽離子交換樹脂優(yōu)化純化及精氨酸倍比稀釋法復性BDNF-TAT融合蛋白,尾靜脈給藥KM種小鼠后研究其腦靶向性及其在腦組織中的分布,體外培養(yǎng)SD大鼠新生一周鼠背根神經節(jié)神經元檢測BDNF-TAT融合蛋白的生物學活性,為進一步研究可透過血腦屏障藥物BDNF-TAT融合蛋白治療神經退行性疾病提供物質基礎。

6、
　　 目的
　　 1.研究重組質粒PET-30(a)-BDNF-TAT轉化至大腸桿菌BL21(DE3)plysS后BDNF-TAT融合蛋白的表達,并優(yōu)化BDNF-TAT融合蛋白在大腸桿菌中表達及純化的條件；
　　 2.小鼠經尾靜脈血管給予復性后BDNF-TAT融合蛋白,探討其在小鼠腦組織中的腦靶向性及在小鼠腦組織中的分布；
　　 3.體外培養(yǎng)新生大鼠背根神經節(jié)神經元細胞,進一步研究復性后BDNF-TAT

7、融合蛋白體外促進神經元存活生長的活性。
　　 方法
　　 1.根據(jù)前期課題組經基因工程辦法制備的重組質粒PET-30(a)-BDNF-TAT及,本文將該重組質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)plysS,37℃,1.0mM IPTG誘導4h后低溫離心(4℃,5000 rpm)收集菌體,超聲裂解,高速離心后收集各步驟樣品,通過15％SDS-PAGE和 Western Blot分析確定融合蛋白BDNF-TAT在大腸桿菌中的表

8、達形式；分別選取25℃、30℃、33℃、37℃、40℃為不同的誘導溫度,對誘導溫度進行優(yōu)化；分別選取0.1mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM為IPTG誘導濃度,對IPTG誘導濃度經行優(yōu)化；選取1、2、4、6、8為誘導時間,對誘導時間經行優(yōu)化；收集各條件下大腸桿菌并經行15％SDS-PAGE和WesternBlot分析確定BDNF-TAT融合蛋白在大腸桿菌中的最佳表達條件。
　　 2.重組質粒轉化至大腸桿菌后,經25℃,0.

9、5mM IPTG誘導4h后離心收集濕菌體,PBS重懸洗滌后用60％強度超聲破碎儀裂解大腸桿菌,4℃、12000rpm低溫高速高速離心去上清,沉淀用2M尿素和0.4％DOC洗滌并重復洗滌一次,低溫高速離心去上清,包涵體沉淀用8M尿素4℃攪拌溶解14h,溶解后蛋白通過中高壓層析系統(tǒng)泵入SP-Sepharose陽離子交換柱,選取pH7.0 NaCl濃度分別為0.1M和0.5M的洗脫液經行梯度沈脫優(yōu)化不同離子強度對目的蛋白的沈脫能力；選取pH8

10、.5,NaCl濃度為0.5M的洗脫液洗脫目的蛋白,對掛柱的目的蛋白經行分離純化。洗脫后目的蛋白用0.4M精氨酸倍比稀釋法除去目的蛋白中的尿素,同時復性融合蛋白BDNF-TAT。收集各步驟蛋白樣品進行15％SDS-PAGE和Western Blot分析,確定最終過柱純化優(yōu)化方案。
　　 3.隨機取9只KM種小鼠作為實驗對象,分為給藥組,陰性對照組和空白對照組,每組3只,將純化復性后的BDNF-TAT融合蛋白溶解于適量生理鹽水,給藥

11、組動物尾靜脈注射4μg BDNF-TAT,而陰性對照組給予等體積生理鹽水,空白對照組不給藥。4h后斷頭取鬧組織,全蛋白提取試劑盒提取腦組織中全蛋白,免疫印跡法(Western Blot)鑒定腦組織中所含BDNF-TAT,對所有組中目的蛋白以β-actin作為內參進行上樣量標準化后,以BDNF-TAT與β-actin灰度值之比為腦組織中BDNF-TAT相對含量,應用單向方差分析方法,比較給藥組,陰性對照組賀空白組之間BDNF-TAT的相對

12、含量是否有統(tǒng)計學意義。
　　 4.隨機取6只KM種小鼠作為實驗對象,分為給藥組和陰性對照組,每組3只,將純化復性后的BDNF-TAT溶解于適量生理鹽水,給藥組動物尾靜脈注射4μg BDNF-TAT,而陰性對照組給予等體積生理鹽水,4h后灌注4％多聚甲醛,斷頭取腦組織,小鼠腦組織4％多聚甲醛浸泡2h后浸入30％蔗糖溶液過夜,10μ m厚度冰凍切片。切片用SABC免疫組織化學法鑒定BDNF-TAT在小鼠腦組織中的分布。
　　

13、 5.摘取新生一周左右SD大鼠背根神經節(jié),經膠原酶Ⅳ和0.25％胰蛋白酶消化后用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)背根神經節(jié)神經元。將神經元細胞分為給藥組,陽性對照組和空白對照組,給藥組中DMEM培養(yǎng)基加入100ng/ml復性后融合蛋白BDNF-TAT,陽性對照組中DMEM培養(yǎng)基加入100ng/ml NGF,空白對照組中DMEM培養(yǎng)基不加入神經營養(yǎng)因子。培養(yǎng)基每2天換一次液,培養(yǎng)4天后用AChE神經元染色方法對神經元經行染色,觀察神

14、經元細胞生長情況。
　　 結果
　　 1.通過15％SDS-PAGE和Western Blot鑒定BDNF-TAT,大腸桿菌中表達BDNF-TAT融合蛋白在分子量約18kD處有表達,且在大腸桿菌裂解沉淀中目的蛋白較多,說明BDNF-TAT融合蛋白以包涵體沉淀形式存在；經不同溫度,IPTG誘導濃度和誘導時間經行優(yōu)化后,誘導溫度在25℃,IPTG誘導濃度為0.5mM誘導4h時BDNF-TAT融合蛋白在大腸桿菌中的表達量最高。

15、
　　 2.經15％SDS-PAGE和Western Blot分析,包涵體蛋白經2M尿素和0.4％DOC洗滌后大部分雜蛋白被洗滌干凈,且8M尿素將大部分包涵體蛋白溶解,溶解后蛋白經SP-Sepharose陽離子交換柱純化后,大部分目的蛋白被pH8.5、NaCl濃度為0.5 M的洗脫液洗脫下來,0.4M精氨酸復性后蛋白純度約為90％,每升菌能產出約4.8 mg目的蛋白。
　　 3.Western Blot鑒定腦組織中BDN

16、F-TAT相對含量,對ECL發(fā)光顯影膠片中給藥組、陰性對照組和空白對照組中BDNF-TAT和β-actin的灰度掃描,以BDNF-TAT和β-actin的灰度比值作為各組中BDNF-TAT蛋白的相對表達量,結果以(x)±s表示,給藥組中BDNF-TAT蛋白的相對表達量為1.897±0.286,陰性對照組中BDNF-TAT蛋白的相對表達量為0.615±0.234,空白對照組中BDNF-TAT蛋白的相對表達量為0.335±0.154。Lev

17、ene檢驗方差齊性(P=0.447>0.05),方差齊。經單方向方差分析,各組間BDNF-TAT蛋白相對表達量有差異(F=39.019,P=0.000<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。LSD法組間多重比較:給藥組中BDNF-TAT相對表達量與陰性對照組中BDNF-TAT相對表達量相比(P=0.000<0.05),差異有統(tǒng)計學意義；給藥組中BDNF-TAT相對表達量與空白對照組中BDNF-TAT相對表達量相比(P=0.000<0.05),差

18、異有統(tǒng)計學意義；而陰性對照組中BDNF-TAT相對表達量和空白對照組中BDNF-TAT相對表達量相比(P=0.188>0.05),差異沒有統(tǒng)計學意義,說明BDNF-TAT通過外周給藥能靶向至小鼠腦組織。
　　 4.SABC免疫組織化學法鑒定BDNF-TAT經尾靜脈給藥KM種小鼠后其在腦組織中的分布,給藥組中融合蛋白BDNF-TAT陽性染色明顯較強,而生理鹽水組中陽性染色明顯弱于給藥組,其陽性染色主要分布于海馬區(qū)CA1、CA3和D

19、G區(qū)。AChE染色神經元后,空白對照組神經元細胞培養(yǎng)4天后胞體較小,細胞大部分死亡,突起較短。而給藥組組和陽性對照組中神經元生長良好,突起較長,細胞數(shù)目明顯較空白對照組多。每組孔中隨機選取10個視野,經Image ProPlus6.0軟件測量細胞最長突起的長度,結果以(x)±s表示,結果給藥組為143±13um,陽性對照組為154±13um,而空白對照組為64±15um,Levene檢驗方差齊性(F=0.039,P=0.961>0.05

20、),方差齊。經單方向方差分析,各組間最長突起的長度有差異(F=126.523,P=0.000),差異有統(tǒng)計學意義。LSD法組間多重比較:給藥組中最長突起長度與陽性性對照組中最長突起長度相比(P=0.087>0.05),差異沒有統(tǒng)計學意義,而給藥組中最長突起長度與空白對照組中最長突起長度相比(P=0.000<0.05),差異有統(tǒng)計學意義；陽性對照組中最長突起長度與空白對照組中最長突起長度相比(P=0.000<0.05),差異有統(tǒng)計學意義,

21、說明BDNF-TAT在體外有能促進神經元突起生長。
　　 通過Image Pro Plus6.0軟件測量神經元胞體總面積,結果給藥組為2686±242um2,陽性對照組為2864±169um2,而空白對照組為397±97um2。Levene檢驗方差齊性(F=0.039,P=0.047<0.05),方差不齊。經Welch分析,各組間神經元胞體總面積有差異(F=997.983,P=0.000),差異有統(tǒng)計學意義。Dunnett T3

22、法組間多重比較:給藥組中神經元胞體總面積與陽性性對照組中神經元胞體總面積相比(P=0.199>0.05),差異沒有統(tǒng)計學意義,而給藥組中神經元胞體總面積與空白對照組中神經元胞體總面積相比(P=0.000<0.05),差異有統(tǒng)計學意義；陽性對照組中神經元胞體總面積與空白對照組中神經元胞體總面積相比(P=0.000<0.05),差異有統(tǒng)計學意義,證明BDNF-TAT在體外有保護神經元生長和存活的生物學活性。
　　 結論
　　

23、 1.BDNF-TAT融合蛋白能通過重組質粒PET-30(a)-BDNF-TAT轉化至大腸桿菌BL21(DE3)plysS中以包涵體形式表達,分子量約為18kD左右。
　　 2.包涵體蛋白經表達純化優(yōu)化并復性后,得到高純度活性BDNF-TAT融合蛋白,每升菌產出目的蛋白約4.8mg,純度約為90％。
　　 3.尾靜脈注射復性后融合蛋白BDNF-TAT經Western Blot分析后,給藥組小鼠腦組織中BDNF-TAT的相

24、對含量較陰性對照組和空白對照組明顯高(P>0.05),且陰性對照組與空白對照組中BDNF-TAT的相對含量無差異(P<0.05),證明復性后融合蛋白BDNF-TAT能通過外周尾靜脈給藥靶向至小鼠腦組織中。
　　 4.SABC免疫組織化學法證明BDNF-TAT融合蛋白經外周尾靜脈給藥小鼠后,腦組織中BDNF-TAT主要分布在海馬區(qū)CA1、CA3和DG區(qū)。
　　 5.體外培養(yǎng)背根神經節(jié)神經元細胞表明,BDNF-TAT融合蛋白