多角體蛋白融合的OPG在大腸桿菌和家蠶細(xì)胞中的表達(dá)與活性測定.pdf

1、破骨細(xì)胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF或稱Osteoprotegerin,OPG)是一種調(diào)節(jié)骨吸收的分泌型糖蛋白。這種糖蛋白稱為骨保護(hù)素,是腫瘤壞死因子受體超家族的一員,具有降血鈣和防止骨質(zhì)流失的作用。目前OPG主要通過CHO細(xì)胞來表達(dá),但其表達(dá)量較低。所以我們嘗試?yán)没蚬こ痰姆椒?探索一種或幾種有效的表達(dá)系統(tǒng)用以大量制備具有生物活性的OPG。
　　 為了提高O

2、PG的表達(dá)量,本研究通過融合家蠶桿狀病毒多角體蛋白(Polyhedrin)分別在大腸桿菌和家蠶細(xì)胞中表達(dá)了OPG。首先,以重組病毒Bm-OPG DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得OPG基因。構(gòu)建重組質(zhì)粒pBacPAK8-OPG、pBacPAK8一Polh-OPG、pET-32a-OPG和pET-32a-Polh-OPG。將原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Polh-OPG轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21并誘導(dǎo)表達(dá),以pET-32a-OPG為對照,分析其表達(dá)

3、量。結(jié)果顯示,在大腸桿菌中融合了Polh的OPG表達(dá)量明顯提高。表達(dá)后的融合蛋白Polh-OPG以包涵體形式存在,經(jīng)變性處理后用Ni2+親和柱純化,SDS-PAGE及Western blotting鑒定得到較純蛋白。利用小鼠降血鈣實驗檢測融合蛋白Polh-OPG的活性,結(jié)果表明Polh-OPG能夠顯著降低小鼠血清鈣離子濃度,具有一定的生物活性。其次,為了分析融合蛋白Polh-OPG在家蠶細(xì)胞中的表達(dá)效果,我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)移載體pFastBa

4、cHTb-Polh-OPG。利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)得到重組Bacmid-Polh-OPG,將其轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞后獲得重組病毒Bm-Polh-OPG。Western blotting分析融合蛋白Polh-OPG與OPG的表達(dá)量差異。結(jié)果表明,融合蛋白Polh-OPG與OPG在家蠶細(xì)胞中的表達(dá)差異不明顯。我們用同樣的方法將以包涵體形式存在的融合蛋白Polh-OPG經(jīng)變性處理后,用Ni2+親和柱純化,得到較純的重組蛋白。小鼠降血鈣實驗表