gfp在大腸桿菌中的誘導表達和檢測解析

1、實驗八：GFP在大腸桿菌中的誘導表達和檢測,XIAMEN UNIVERSITY,宋 剛 2188275 gangsongsd@hotmail.com廈門大學抗癌研究中心,一．實驗目的,掌握外源基因在原核細胞中表達的特點和方法。復習SDS-PAGE的制備及其分離原理。,二．原核表達的一般流程,獲得目的基因 → → 準備表達載體 → → 將目的基因插入表達載體中（測序驗證） → → 轉化表達宿主菌 → → 誘導靶蛋白的表達 →

2、 → 表達蛋白的分析→ →擴增、純化、進一步檢測,原核表達：將克隆化基因插入合適載體后導入大腸桿菌用于表達大量蛋白質的方法一般稱為原核表達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應用。大腸桿菌用于表達重組蛋白有以下特點： ——易于生長和控制； ——用于細菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動物細胞系統(tǒng)的材料昂貴； ——有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質粒可供選擇。 ——但是，在大腸桿菌中表達的蛋白由

3、于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學活性及構象。,三．實驗原理,表達載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達載體通常為質粒，典型的表達載體應具有以下幾種元件： ——選擇標志的編碼序列； ——可控轉錄的啟動子； ——轉錄調控序列(轉錄終止子，核糖體結合位點)； ——一個多限制酶切位點接頭； ——宿主體內自主復制的序列。,原核表達載體：,pET載體系統(tǒng),本實驗

4、介紹一種常用的表達載體――pET載體系統(tǒng)。 ——在pET系列載體中，外源基因的表達受T7噬菌體RNA聚合酶的調控，這類載體是Studier等于1990年首先構建的，后來得到很大發(fā)展。 ——帶有pBR322的大腸菌素E1 (colEl)復制區(qū)。從而賦予宿主菌氨節(jié)青霉素或卡那霉素抗性。在這些載體中，編碼序列在多克隆位點插入，置于天然T7 RNA聚合酶啟動子(φ10啟動子)或所謂的T7 lac啟動子的控制之下，后者是帶有l(wèi)ac操縱子(

5、 larO)序列的天然T7 RNA聚合酶啟動子的衍生體。lac阻抑物的結合能阻斷轉錄起始。,將外源基因克隆在含有l(wèi)ac啟動子的pET-30a表達載體（如圖1）中，讓其在E.coli中表達。先讓宿主菌生長，lacI產生的阻遏蛋白與lacI操縱基因結合，從而不能進行外源基因的轉錄與表達，此時宿主菌正常生長。然后向培養(yǎng)基中加入lac操縱子的誘導物IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖 )，阻遏蛋白不能與操縱基因結合，則DNA外源基因大量轉錄并高

6、效表達，表達蛋白可經SDS-PAGE檢測。,,,,,SDS-PAGE分離蛋白原理,組成蛋白質的氨基酸在一定pH的溶液中會發(fā)生解離而帶電，帶電的性質和帶電量的多少取決于蛋白質的性質及溶液的pH值和離子強度。聚丙烯酰胺凝膠在催化劑過硫酸銨（簡稱Ap）和加速劑N,N,N’N’-四甲基乙二胺（簡稱TEMED）的作用下，聚合形成三維的網(wǎng)狀結構。蛋白質在凝膠中受電場的作用而發(fā)生遷移，不同種蛋白在凝膠的網(wǎng)狀結構中遷移的速率不同，其速率取決于蛋白質所

7、帶電荷的多少和蛋白質的大小和形狀。根據(jù)遷移速率的不同，可將不同的蛋白質進行分離。,SDS-PAGE 是在蛋白質樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級和三級結構。 強還原劑巰基乙醇可以斷開二硫鍵破壞蛋白質的四級結構。使蛋白質分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側鏈與SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物。 蛋白質分子結合SDS陰離

8、子后，所帶負電荷的量遠遠超過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質之間所帶凈電荷的差異。蛋白質的電泳遷移率主要決定于亞基的相對分子質量。而與其所帶電荷的性質無關。,四．實驗材料,五．實驗步驟,1．目的蛋白的表達（1）含外源基因的表達菌株在LB培養(yǎng)基（含50μg/ml Kana）中預培養(yǎng)過夜（2）按1/50的比例稀釋菌液，于250r/min，培養(yǎng)3小時,使其OD600值達到0.6（3）加入IPTG，使其終濃度為0.5mmol/L

9、（4）繼續(xù)培養(yǎng) 小時（5）取1.5ml菌液于10000r/min，離心2min，收獲菌體,2．目的蛋白的檢測（1）凝膠制備 分離膠和濃縮膠分別按下表中的配方進行制備。先制分離膠，將分離膠注入玻板后，用去離子水封口，約30~40min后凝聚。將膠面的水吸干后灌注濃縮膠，并插入梳子，膠凝固后即可。（2）凝膠電泳 取80 ml 電極緩沖液稀釋5倍后，分別注入陰極電泳槽和陽極電泳槽中。然后在加樣孔中加入已經處理

10、好的蛋白樣品。80V恒壓20分鐘，120V恒壓2小時 （3）染色、脫色 電泳完畢，剝膠后，在搖床上染色0.5~1 小時；之后，在脫色液中脫色1小時，觀察目的蛋白表達情況。,五．注意事項,1．含外源基因的表達菌株應預培養(yǎng)之后再轉接至培養(yǎng)瓶中，最好不要將菌種直接接于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，誘導表達。2．表達菌生長至OD600值0.6左右為誘導適合條件，避免菌生長過濃。3．配制SDS膠時應注意充分混勻后加入玻璃板中，并待其充分凝固后使用。,