設(shè)計(jì)抗菌肽在大腸桿菌中的表達(dá)及其活性研究.pdf

1、抗菌肽是對(duì)多種微生物、病毒、原蟲甚至癌細(xì)胞都有明顯抑殺作用的小分子多肽，廣泛存在于生物體內(nèi)?？咕牡目咕鷻C(jī)理與通過阻斷細(xì)菌生物大分子合成的抗生素抑菌機(jī)理完全不同，細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性，因此抗菌肽非常有望成為替代抗生素的新型抗菌藥物。天蠶素是現(xiàn)有昆蟲抗菌肽中最大的一族，具有抗菌譜廣、毒副作用小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但是目前天蠶素的抑菌機(jī)理、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系還不十分明確，這使的通過分子改造或全新設(shè)計(jì)生產(chǎn)，表達(dá)高活性抗菌肽的研究受到限制。本課題在前期

2、研究天蠶素保守序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了四條抗菌肽AMP-A/B/C/D。本論文將通過基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)四種抗菌肽，研究各抗菌肽的抑菌活性，并且利用生物信息學(xué)方法初步分析抗菌肽的結(jié)構(gòu)與抑菌活性關(guān)系，為今后設(shè)計(jì)、表達(dá)活性更高的抗菌肽提供技術(shù)資料。 AMP-A/B/C/D全基因的合成及其克隆。根據(jù)大腸桿菌表達(dá)偏好密碼子，將AMP-A/B/C/D多肽序列反翻譯為核酸序列；采用分段化學(xué)合成的方法合成全基因序列的5個(gè)DNA片段；利用PC

3、R反應(yīng)將短的DNA片段連接起來，并引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoRⅠ和HindⅢ。四條全基因和載體PUC19分別經(jīng)雙酶切及連接反應(yīng)，得到重組質(zhì)粒PUC19-AMP-A/B/C/D。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化“感受態(tài)”大腸桿菌JM109中，構(gòu)建基因工程菌JM109-A/B/C/D。測(cè)序分析表明四條抗菌肽全基因已經(jīng)按照正確的閱讀框插入到載體中。 抗菌肽的誘導(dǎo)表達(dá)及溴化氰切割多肽。IPTG誘導(dǎo)工程菌并利用SDS-PAGE凝膠電泳鑒定表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果表明表

4、達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形成存在。正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件后，大量培養(yǎng)工程菌。收集并破碎菌體，待菌體破碎完全后離心法分離得到包涵體。洗滌包涵體，除去附著的細(xì)菌膜蛋白等雜質(zhì)。用6M鹽酸胍/2M鹽酸溶解包涵體，并加入溴化氰裂解表達(dá)產(chǎn)物，除去其N端的融合蛋白及部分信號(hào)肽。透析除去小分子后，冷凍干燥。 利用稀釋藥敏實(shí)驗(yàn)和抑菌圈法測(cè)定設(shè)計(jì)抗菌肽抑菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMP-A沒有抑菌活性；AMP-B/C/D均表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性，它們的最小抑菌濃度(