蚯蚓29肽抗菌活性分析以及基因在大腸桿菌中的表達.pdf

1、抗菌肽是指具有抗菌活性的小分子多肽，是生物體天然免疫防御系統(tǒng)中不可或缺的一部分。蚯蚓生活在惡劣環(huán)境中，經(jīng)過長時間的進化，能夠產(chǎn)生多種抗菌成分，形成自己獨特的防御外來微生物入侵的機制。
　　 本研究根據(jù)與抗菌肽EAP-1蛋白質(zhì)序列相似性極高的LumbricinⅠ(6-34)的序列，人工合成了29肽。采用菌落計數(shù)法對該29肽的抗菌譜、作用時間、最低抑制濃度，以及耐熱性進行了研究。實驗結(jié)果證明29肽具有以下特性：1)廣譜性，即不僅能有

2、效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球等常見細菌，而且還能夠抑制釀酒酵母、露濕漆斑菌、總狀毛霉等真菌；2)活力高，當濃度為0.009mg/mL時對大腸桿菌就有明顯抑制效果；3)穩(wěn)定性強，在pH為2.2或11的環(huán)境中抑菌活性不變，而且在煮沸10分鐘后仍能保留80％以上的活性。
　　 根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，設(shè)計了29肽單鏈編碼DNA，通過兩步PCR得到雙鏈DNA基因，并獲得pMD19-T-29aa克隆載體。測序證明，克隆的序列與原設(shè)計一致

3、。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了融合表達載體pGEX-4T-2-29aa和非融合表達載體pBV221-29aa，并進行了轉(zhuǎn)化、誘導和表達。SDS-PAGE結(jié)果表明，兩個載體分別表達了融合的GST-29肽和游離的29肽產(chǎn)物。盡管融合蛋白GST-29肽表達明顯，并以可溶性的狀態(tài)存在，但經(jīng)凝血酶作用去掉GST標簽后的游離29肽沒檢測到具有抑菌活性，推測可能由于切點處多了兩個氨基酸影響到29肽的活性結(jié)構(gòu)。非融合載體表達的游離29肽產(chǎn)物以包涵體形式存在，雖然表