抗菌肽Dermaseptin S4及其突變體基因在大腸桿菌中的融合表達(dá).pdf

1、目的：優(yōu)化設(shè)計(jì)抗菌肽Dermaseptin S4(DS4)基因及其突變體K4-S4基因，利用重疊延伸PCR技術(shù)(SOE PCR)擴(kuò)增DS4基因及K4-S4基因，構(gòu)建pGEX-4T-1-DS4及pGEX-4T-1-K4-S4表達(dá)重組體；并在大腸桿菌BL21中對(duì)DS4及K4-S4表達(dá)重組體進(jìn)行融合表達(dá)及純化。 方法：根據(jù)抗菌肽DS4及K4-S4的氨基酸序列，按照Codon Usage Database中大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子原則對(duì)DS

2、4基因及K4-S4基因進(jìn)行優(yōu)化，利用DNA Star和Oligo 6.0分別設(shè)計(jì)合成了4個(gè)寡聚核苷酸片段，通過(guò)SOE PCR獲得DS4基因及突變體K4-S4基因，定向克隆入載體PUC-18中，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定成功得到目的基因后，重組至融合表達(dá)載體pGEX-4T-1中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)plyS中，篩選得到陽(yáng)性克隆，經(jīng)IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別在不同的誘導(dǎo)溫度(37℃、30℃)、誘導(dǎo)時(shí)間(2-5h)、誘導(dǎo)濃度(0.1mM、1

3、.0mM)下進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化，進(jìn)行15％SDS-PAGE電泳顯示，可表達(dá)出GST融合目的蛋白；經(jīng)谷胱甘肽親和層析柱純化得到特異性目的蛋白。 結(jié)果： 1.通過(guò)SOE PCR，得到DS4及其突變體K4-S4目的基因片段，大小為103bp； 2.構(gòu)建了克隆重組體PUC-18-DS4及PUC-18-K4-S4，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果表明正確獲得目的基因。 3.構(gòu)建了表達(dá)重組體pGEX-4T-1-DS4及pGEX

4、-4T-1-K4-S4，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)plyS中，經(jīng)酶切和測(cè)序，結(jié)果表明DS4基因及K4-S4基因與表達(dá)載體連接方向正確，可以進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 4.兩種表達(dá)菌經(jīng)0.1mM IPTG 30℃誘導(dǎo)5h時(shí)后，全菌體及上清進(jìn)行15％ SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示有32KD的融合蛋白條帶出現(xiàn)且以可溶性形式存在于上清中。 5.表達(dá)的融合蛋白經(jīng)谷胱甘肽親和層析柱純化，進(jìn)行15％ SDS-PAGE電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)得到了