抗菌肽Dermaseptin S4在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)與純化.pdf

1、目的：利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽Dermaseptin S46串聯(lián)體，并對(duì)其進(jìn)行純化和鑒定。為進(jìn)一步研究抗菌肽Dermaseptin S4結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.根據(jù)抗菌肽Dermaseptin S4的氨基酸序列及真核生物偏愛(ài)密碼子，推出Dermaseptin S4編碼基因的序列，并將Dermaseptin S4基因通過(guò)連接肽(GATAGGTAGCG)將六個(gè)基因片段連

2、接在一起，形成Dermaseptin S46串聯(lián)體基因，并在六串聯(lián)體的兩側(cè)分別加上了Xbal和SalⅠ的限制酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出目的基因，并通過(guò)化學(xué)合成方法將Dermaseptin S46串聯(lián)體基因合成。
　　 2.將抗菌肽基因Dermaseptin S4六串聯(lián)體克隆到BAC-TO-BACTM重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的pFASTBac1載體中，構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)座載體pFASTBac6Dermaseptin S4，抽提重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定。 <

3、br>　　 3.將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白篩選，挑取陽(yáng)性重組菌落，抽提重組質(zhì)粒以通用引物RV作為引物進(jìn)行PCR鑒定。
　　 4.獲得重組成功的Bacmid DNA，并轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)草地夜蛾(Bombyx mandafina)St9細(xì)胞出現(xiàn)病變后，收集含有重組病毒顆粒的培養(yǎng)上清，重新感染草地夜蛾SD單層細(xì)胞，收集SD細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞再進(jìn)行SDS-PAGE及Western blot5.用ProB

4、ondTM純化系統(tǒng)(Invitrogen公司產(chǎn)品)采用非變性條件對(duì)抗菌肽Dermaseptin S4蛋白進(jìn)行純化。
　　 結(jié)果：
　　 1.重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、PCR及測(cè)序鑒定，證明成功構(gòu)建了pFASTBac6Dermaseptin S4質(zhì)粒。
　　 2.12％聚丙烯酰胺凝膠電泳可見(jiàn)表達(dá)的目的蛋白帶，分子量大小為27000，與理論值相符，灰度掃描顯示，表達(dá)量約占細(xì)胞總蛋白的20.1％.Western blo