鯰魚(yú)抗菌肽ParasinⅠ及突變體在大腸桿菌中融合表達(dá).pdf

1、目的：獲得正常Parasin Ⅰ DNA序列，依據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道及生物信息學(xué)方法，尋找合適的突變位點(diǎn)，并將天然型(Parasin Ⅰ)與突變型(m Parasin Ⅰ)分別在大腸桿菌中融合表達(dá)，初步測(cè)定天然型肽及突變后肽的抗菌活性，為進(jìn)一步研究Parasin Ⅰ結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．根據(jù)Parasin Ⅰ的氨基酸序列及大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，推出Parasin Ⅰ編碼基因的序列，并在Parasin Ⅰ基因的

2、兩側(cè)分別加上了EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ的限制酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出目的基因。通過(guò)化學(xué)合成方法，獲得含EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ識(shí)別序列的Parasin Ⅰ基因。 2．將Parasin Ⅰ基因與克隆載體pUC-57連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍(lán)白篩選，挑取陽(yáng)性菌落，抽提重組質(zhì)粒鑒定后測(cè)序。測(cè)序正確后將陽(yáng)性重組質(zhì)粒和融合表達(dá)載體pGEX-4T-1經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切，16℃連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取菌落，抽提重組質(zhì)粒鑒定并

3、測(cè)序。 3．依據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，尋找合適的突變位點(diǎn)，利用RCR定點(diǎn)突變技術(shù)將Parasin Ⅰ DNA序列中第18位絲氨酸密碼子AGT突變?yōu)楦拾彼崦艽a子GGC、第19位絲氨酸密碼子AGC突變?yōu)橘嚢彼崦艽a子AAA。 4．將鑒定為陽(yáng)性的兩種重組菌落用IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)2～5小時(shí)，全菌體蛋白SDS-PAGE電泳觀察表達(dá)結(jié)果。將表達(dá)的含融合蛋白的大腸桿菌BL21經(jīng)B-PER GST Spin純化試劑盒純化，用凝血酶切割融合

4、蛋白，Glutathione- Sepharase4B親和層析柱純化。最后用抑菌圈實(shí)驗(yàn)初步鑒定天然肽及突變肽的抗菌活性。 結(jié)果： 1．化學(xué)合成的Parasin Ⅰ DNA片段與克隆載體PUC-57連接并測(cè)序，結(jié)果表明與預(yù)先設(shè)計(jì)的Parasin Ⅰ DNA序列一致。 2．Parasin Ⅰ基因及與融合表達(dá)載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，抽提重組質(zhì)粒鑒定，測(cè)序結(jié)果表明Parasin Ⅰ基因及與融合表達(dá)載體連接方向正確

5、，可以進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 3．依據(jù)Parasin Ⅰ結(jié)構(gòu)及相關(guān)文獻(xiàn)資料設(shè)計(jì)突變位點(diǎn),PCR定點(diǎn)突變技術(shù)突變后測(cè)序結(jié)果表明Parasin Ⅰ DNA序列中第18位絲氨酸密碼子AGT突變?yōu)楦拾彼崦艽a子GGC、第19位絲氨酸密碼子AGC突變?yōu)橘嚢彼崦艽a子AAA，達(dá)到預(yù)期突變結(jié)果。 4．經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2-5小時(shí)后，SDS-PAGE電泳結(jié)果可見(jiàn)28KD的融合蛋白條帶。表達(dá)的融合蛋白經(jīng)B-PER GST Spin純化試劑盒純化回收，

6、得到可溶形式的融合蛋白。 5．用凝血酶對(duì)融合蛋白切割分離GST-Parasin Ⅰ蛋白、GST-m Parasin Ⅰ純化后對(duì)Parasin Ⅰ及m Parasin多肽的抗菌活性用抑菌圈實(shí)驗(yàn)鑒定，二者對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25938有一定的抑菌作用。 結(jié)論：成功構(gòu)建了Parasin Ⅰ成熟肽及突變體，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)成功，經(jīng)純化后，初步獲得了具有抑菌活性的Parasin及mParasin多肽。為下一步蛋白抗菌活性