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文檔簡介
1、目的:獲得正常Parasin Ⅰ DNA序列,依據(jù)相關的文獻報道及生物信息學方法,尋找合適的突變位點,并將天然型(Parasin Ⅰ)與突變型(m Parasin Ⅰ)分別在大腸桿菌中融合表達,初步測定天然型肽及突變后肽的抗菌活性,為進一步研究Parasin Ⅰ結構與功能的關系奠定基礎。 方法: 1.根據(jù)Parasin Ⅰ的氨基酸序列及大腸桿菌偏愛密碼子,推出Parasin Ⅰ編碼基因的序列,并在Parasin Ⅰ基因的
2、兩側分別加上了EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ的限制酶切位點,設計出目的基因。通過化學合成方法,獲得含EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ識別序列的Parasin Ⅰ基因。 2.將Parasin Ⅰ基因與克隆載體pUC-57連接、轉化大腸桿菌DH5 α,經(jīng)藍白篩選,挑取陽性菌落,抽提重組質(zhì)粒鑒定后測序。測序正確后將陽性重組質(zhì)粒和融合表達載體pGEX-4T-1經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切,16℃連接、轉化大腸桿菌BL21,挑取菌落,抽提重組質(zhì)粒鑒定并
3、測序。 3.依據(jù)相關的文獻報道,尋找合適的突變位點,利用RCR定點突變技術將Parasin Ⅰ DNA序列中第18位絲氨酸密碼子AGT突變?yōu)楦拾彼崦艽a子GGC、第19位絲氨酸密碼子AGC突變?yōu)橘嚢彼崦艽a子AAA。 4.將鑒定為陽性的兩種重組菌落用IPTG 37℃誘導表達2~5小時,全菌體蛋白SDS-PAGE電泳觀察表達結果。將表達的含融合蛋白的大腸桿菌BL21經(jīng)B-PER GST Spin純化試劑盒純化,用凝血酶切割融合
4、蛋白,Glutathione- Sepharase4B親和層析柱純化。最后用抑菌圈實驗初步鑒定天然肽及突變肽的抗菌活性。 結果: 1.化學合成的Parasin Ⅰ DNA片段與克隆載體PUC-57連接并測序,結果表明與預先設計的Parasin Ⅰ DNA序列一致。 2.Parasin Ⅰ基因及與融合表達載體連接、轉化大腸桿菌BL21,抽提重組質(zhì)粒鑒定,測序結果表明Parasin Ⅰ基因及與融合表達載體連接方向正確
5、,可以進行誘導表達。 3.依據(jù)Parasin Ⅰ結構及相關文獻資料設計突變位點,PCR定點突變技術突變后測序結果表明Parasin Ⅰ DNA序列中第18位絲氨酸密碼子AGT突變?yōu)楦拾彼崦艽a子GGC、第19位絲氨酸密碼子AGC突變?yōu)橘嚢彼崦艽a子AAA,達到預期突變結果。 4.經(jīng)IPTG誘導表達2-5小時后,SDS-PAGE電泳結果可見28KD的融合蛋白條帶。表達的融合蛋白經(jīng)B-PER GST Spin純化試劑盒純化回收,
6、得到可溶形式的融合蛋白。 5.用凝血酶對融合蛋白切割分離GST-Parasin Ⅰ蛋白、GST-m Parasin Ⅰ純化后對Parasin Ⅰ及m Parasin多肽的抗菌活性用抑菌圈實驗鑒定,二者對金黃色葡萄球菌ATCC25938有一定的抑菌作用。 結論:成功構建了Parasin Ⅰ成熟肽及突變體,并在大腸桿菌中誘導表達成功,經(jīng)純化后,初步獲得了具有抑菌活性的Parasin及mParasin多肽。為下一步蛋白抗菌活性
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