抗菌肽DCD-1L與增強型綠色熒光蛋白在大腸桿菌Transetta中的融合表達.pdf

1、綠色熒光蛋白(GFP)在生物學領域中常被用作報導基因，目前應用較多的是GFP的突變體-增強型綠色熒光蛋白(EGFP)。利用EGFP特有的發(fā)光機制和DNA重組技術(shù)，將目的基因與EGFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化至合適的細胞進行表達，而后借助熒光顯微鏡觀察所標記蛋白的技術(shù)已被廣泛應用。Dermcidin(DCD)是從人汗腺中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽，DCD-1L是DCD的衍生物，具有廣譜的抗菌活性?？咕腄CD-1L以其理化性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜廣、不易產(chǎn)

2、生耐藥性等特點，有望成為抗生素的最佳替代品。本文首先將EGFP基因在大腸桿菌Transetta中進行表達；然后將EGFP與DCD-1L基因在大腸桿菌Transetta中進行融合表達，利用EGFP特有的發(fā)光機制標記DCD-1L，以便精確的檢測DCD-1L的表達水平。取得了以下成果：
　　 1.從質(zhì)粒pEGFP-N1中PCR擴增獲得了EGFP基因；
　　 2.構(gòu)建了重組質(zhì)粒PET-32a(+)-EGFP；
　　 3.

3、將重組質(zhì)粒PET-32a(+)-EGFP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Transetta中并表達，表達產(chǎn)物經(jīng)熒光顯微鏡檢測發(fā)出明顯的綠色熒光，EGFP基因成功表達。
　　 4.通過重疊延伸PCR法獲得了DCD-1L基因；
　　 5.構(gòu)建了重組質(zhì)粒PET-32a(+)-EGFP-DCD-1L；
　　 6.對重組質(zhì)粒PET-32a(+)-EGFP-DCD-1L進行測序，發(fā)現(xiàn)EGFP基因下游末端的堿基T缺失，導致其后的堿基移碼突變；<

4、br>　　 7.將重組質(zhì)粒PET-32a(+)-EGFP-DCD-1L轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Transetta中并表達，表達產(chǎn)物經(jīng)熒光顯微鏡檢測發(fā)出綠色熒光，但SDS-PAGE凝膠電泳未檢測到融合蛋白條帶。經(jīng)過分析，發(fā)現(xiàn)引物P2’3’端的堿基A在引物合成過程中缺失，導致在PCR過程中EGFP基因下游末端的堿基T缺失。目前已重新合成了引物P2’，實驗正在進行中。
　　 本研究獲得了EGFP和DCD-1L基因；構(gòu)建了重組質(zhì)粒PET-32a