增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí)

2、 生物技術(shù) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</b

3、></p><p><b>　　摘要3-I</b></p><p>　　ABSTRACT錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p><b>　　引 言3</b></p><p><b>　　1 材料與方法5</b></p><p><b>

4、;　　1.1材料5</b></p><p>　　1.1.1 菌株與質(zhì)粒5</p><p>　　1.1.2 工具酶及試劑5</p><p>　　1.1.3 培養(yǎng)基5</p><p><b>　　1.2方法5</b></p><p>　　1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成5</p

5、><p>　　1.2.2 目的基因EGFP編碼序列的克隆5</p><p>　　1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定6</p><p>　　1.2.4 目的片段回收6</p><p>　　1.2.5 連接6</p><p>　　1.2.6 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備6</p><p>　

6、　1.2.7 轉(zhuǎn)化7</p><p>　　1.2.8 陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定7</p><p>　　1.2.9 pMD19-EGFP質(zhì)粒的抽提8</p><p>　　1.2.10 重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP的構(gòu)建及鑒定8</p><p>　　1.2.11 轉(zhuǎn)EGFP基因大腸桿菌的獲得及原核表達(dá)條件的研究10</p>

7、<p>　　2 結(jié)果與分析11</p><p>　　2.1目的基因EGFP編碼片段的克隆11</p><p>　　2.2pMD19-EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定11</p><p>　　2.3重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP的構(gòu)建和鑒定12</p><p>　　2.4轉(zhuǎn)EGFP基因的大腸桿菌原核表達(dá)條件的研究13&l

8、t;/p><p><b>　　3 討論14</b></p><p><b>　　4 結(jié)論15</b></p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　參考文獻(xiàn)錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　摘要：綠色熒光蛋白(green fluorescent p

9、rotein，GFP)基因是在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，在藍(lán)光或長(zhǎng)紫外光的激發(fā)下，不需要任何反應(yīng)底物及其他輔助因子就能發(fā)出綠色熒光的新型報(bào)告基因。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)是GFP的一個(gè)突變體，發(fā)出的熒光強(qiáng)度要比GFP大六倍以上，更適合作為一種報(bào)告基因來(lái)研究基因表達(dá)、調(diào)控、細(xì)胞分化及蛋白質(zhì)在生物體定位和轉(zhuǎn)運(yùn)等。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建以EGFP為標(biāo)記的原核表達(dá)載體，觀察EGFP基因在

10、大腸桿菌中的表達(dá)情況，探索其作為報(bào)告基因在以后研究中應(yīng)用的可能性。根據(jù)已知的EGFP序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物FEGFP和REGFP，分別含有NdeI和EcoRI酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR從pFGC-EGFP質(zhì)粒中克隆EGFP編碼序列，并將其與pMD19 T-Vector連接，以此構(gòu)建pMD19-EGFP。將其雙酶切后與pET-28a連接，得到重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在誘導(dǎo)的不同時(shí)間收集菌體沉淀，并

11、置于長(zhǎng)波紫外線下照射，觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)量。經(jīng)IPT</p><p>　　關(guān)鍵詞：增強(qiáng)型綠色熒光蛋白；重組質(zhì)粒；大腸桿菌；原核表達(dá)</p><p>　　Abstract: The green fluorescent protein (GFP)gene is a new reporter gene which can be expressed in living cells, un

12、der excitation of long UV light or blue light, green fluorescence can be emitted without other external substrate. The enhanced green fluorescent protein(EGFP)is a mutant of GFP，which can emit six time higher fluorescenc

13、e. As a reporter gene, it is more suitable for studying gene expression and regulation, cell differentiation and protein localization and transfer in living organism</p><p>　　Keyword: EGFP; recombinant plasm

14、id; E.coli; prokaryotic expression</p><p><b>　　引 言</b></p><p>　　在水母、水螅和珊瑚等腔腸動(dòng)物體內(nèi)存在一類生物發(fā)光蛋白——綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)[1]。它在紫外或藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，依靠鈣離子的幫助能夠發(fā)出綠色熒光，并在活細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。GFP

15、的分子量為27kD，由238個(gè)氨基酸構(gòu)成，由11個(gè)β片層組成桶狀構(gòu)成疏水中心，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發(fā)光團(tuán)，是主要發(fā)光的位置。發(fā)光的過(guò)程中還需要冷光蛋白(Aequorin)的幫助，且這個(gè)冷光蛋白與鈣離子可產(chǎn)生交互作用，由此產(chǎn)生綠色熒光[2]。它在395nm處具有最大吸收高峰，在475nm處還有一個(gè)肩峰[3]。作為一種新型的標(biāo)記分子，GFP具有諸多優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注：(1)便于檢測(cè)：無(wú)需底物和輔助因子提供能源，可被

16、光直接激發(fā)；(2)熒光特性穩(wěn)定：對(duì)高溫(60℃) 、堿性、除垢劑、鹽、有機(jī)溶劑等大多具有較強(qiáng)抗性，對(duì)光漂白有較強(qiáng)的耐受性，(3)對(duì)細(xì)胞或組織無(wú)毒害：GFP與目的基因融合后對(duì)目的基因的表達(dá)沒(méi)有多大的影響，也不會(huì)損害宿主細(xì)胞；(4)通用性和共用性：GFP的表達(dá)不受宿主范圍的限制，也沒(méi)有細(xì)胞種類和部位的限制；(5)分子量小，便于</p><p>　　正是由于GFP具有上述優(yōu)點(diǎn)，它在分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究中有廣闊的應(yīng)

17、用前景。不同種的蛋白質(zhì)N端或C端能與GFP融合，但其天然蛋白的特性又不會(huì)受到影響，因此，GFP能用來(lái)研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位、轉(zhuǎn)移、相互作用，作為一種“熒光標(biāo)簽”，它可用于研究。Baulcombe等將馬鈴薯X病毒和融合蛋白載體PVX-GFP接種菸草(N. clevelandii) 1～2d 后，在紫外光下可以直接觀察到病毒侵染的確切部位[9]。KÖhler等用擬南芥葉綠體蛋白的recA序列連接GFP，結(jié)果表明GFP標(biāo)記的rec

18、A序列存在于葉綠體的基質(zhì)中[10]。</p><p>　　GFP常常用于構(gòu)建基因工程的表達(dá)載體。Summers等用GFP作為報(bào)告基因構(gòu)建兩種轉(zhuǎn)錄型的穿梭報(bào)告載體并用于絲狀藍(lán)藻的研究[11]。Gupta等利用GFP構(gòu)建載體并使其在大腸桿菌重組突變體中的過(guò)量表達(dá)[12]。孫麗萍等構(gòu)建了人NOD2基因啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，為進(jìn)一步深入探索NOD2啟動(dòng)子的始動(dòng)原因及調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)[13]

19、。姜伯樂(lè)等將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因編碼序列克隆到不含啟動(dòng)子的載體pLAFR6上，構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒pLZY，為研究目的基因在不同宿主中的表達(dá)和研究植物病原細(xì)菌Ⅲ型效應(yīng)物蛋白的植物亞細(xì)胞定位提供了材料[14]。何淑雅等將攜帶人脆性X相關(guān)基因1(Fragile X related gene l，F(xiàn)XR1)與EGFP的融合并構(gòu)建表達(dá)載體，為研究FXR1基因在脆性X 綜合征中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)[15]。張?chǎng)H等構(gòu)建了大腸桿菌雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體，并中研究綠

20、色熒光蛋白的表達(dá)水平[16]。</p><p>　　盡管GFP作為報(bào)告基因具有許多優(yōu)點(diǎn)，但天然的GFP仍存在一些缺陷而使其無(wú)法更好地應(yīng)用于科學(xué)研究，如發(fā)光較弱，耐光性差。為了解決上述問(wèn)題，需要對(duì)GFP作出一些改進(jìn)，主要包括以下兩個(gè)方面：(1)改變GFP的熒光強(qiáng)度，(2)改變GFP的顏色。通過(guò)點(diǎn)突變的方法將Ser65→Thr，增強(qiáng)了熒光強(qiáng)度，另外，Phe64→Leu點(diǎn)突變使GFP在哺乳動(dòng)物細(xì)胞37℃的培養(yǎng)條件下能更

21、有效地進(jìn)行構(gòu)象折疊。向GFP引入遺傳突變可以獲得不同顏色的變種，改變GFP顏色的點(diǎn)突變主要針對(duì)其65-67的發(fā)光位點(diǎn)及構(gòu)象上接近發(fā)光位點(diǎn)的氨基酸[17-19]。增強(qiáng)型GFP(enhanced GFP)是其中最具有代表性的一種，它的熒光強(qiáng)度顯著提高。因此更適合作為報(bào)告基因來(lái)研究基因的表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白運(yùn)輸與定位等。</p><p>　　在蛋白水平檢測(cè)導(dǎo)入的外源基因是否表達(dá)的過(guò)程中，我們往往需要通過(guò)多次的蛋白純化和

22、電泳檢測(cè)的步驟或者通過(guò)Western 雜交的方法，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，步驟繁瑣，無(wú)法迅速得知蛋白是否表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)可以利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白為標(biāo)記構(gòu)建一個(gè)可以直觀地觀察蛋白表達(dá)情況的原核表達(dá)載體pET-28a-EGFP，試圖在大腸桿菌中克隆并高效表達(dá)該載體，以利進(jìn)一步研究其生化特，并進(jìn)一步探索其作為報(bào)告基因的優(yōu)勢(shì)，為其在以后的研究奠定基礎(chǔ)。</p><p><b>　　材料與方法</b></

23、p><p><b>　　材料</b></p><p><b>　　菌株與質(zhì)粒 </b></p><p>　　大腸桿菌DH5α、Top10和BL21菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pFGC-EGFP，pET-28a為本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pMD19-T購(gòu)自TaKaRa公司。</p><p>　　工具酶及試劑

24、 </p><p>　　小量膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒及IPTG均購(gòu)自上海生物工程公司，限制性內(nèi)切酶EcoR I、Nde I、Solution I、DNA marker均購(gòu)自TaKaRa公司，其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。</p><p><b>　　培養(yǎng)基 </b></p><p>　　采用LB培養(yǎng)基，其他試劑及培養(yǎng)基均由本實(shí)驗(yàn)

25、室配制。</p><p><b>　　方法</b></p><p>　　引物設(shè)計(jì)及合成 </p><p>　　根據(jù)GenBank中已知的EGFP編碼序列，自行設(shè)計(jì)1對(duì)引物FEGFP、REGFP。</p><p>　　上游引物FEGFP：5＇-CCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3＇，含有Nde I酶切位

26、點(diǎn)，</p><p>　　下游引物REGFP：5＇-GGAATTCCTAGGATCCCTTGTACAGCT-3＇，含有EcoR I酶切位點(diǎn)。</p><p>　　引物由上海生物工程公司合成。</p><p>　　目的基因EGFP編碼序列的克隆 </p><p>　　以實(shí)驗(yàn)室存有的質(zhì)粒pFGC-EGFP為模板，分別以引物FEGFP、REGF

27、P進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：</p><p><b>　　反應(yīng)程序設(shè)置如下：</b></p><p>　　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定</p><p>　　稱取0.2g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入50×TAE電泳緩沖液50ml，置于微波爐中加熱至瓊脂糖完全融化，一般煮沸三次，配制成1%瓊脂糖凝膠溶液。將EB加入錐形瓶中并混勻，之后

28、倒入選定的膠膜中，插入相應(yīng)的梳子。過(guò)20min后待凝膠完全凝固，小心拔出梳子，將凝膠放入裝有50×TAE電泳緩沖液的電泳槽中，使電泳液剛沒(méi)過(guò)膠面（1mm），取5μl待電泳的DNA樣品與1μl 的6×Loading Buffer在封口膜上混勻，用移液槍將樣品加到梳孔中，以100V電泳20min左右，在紫外燈下觀察結(jié)果和拍照。</p><p><b>　　目的片段回收</b>

29、</p><p>　　打開(kāi)水浴鍋，將溫度設(shè)到55-60℃，待溫度上升后將Elution Buffer放在水浴鍋里預(yù)熱。</p><p>　　將空的Eppendorf管置于電子天平上稱重，記下重量之后將切下的膠塊放入管中再稱重量，兩者相減，若兩者之差小于300mg（針對(duì)1%瓊脂糖凝膠溶液），再加入300μl Binding BufferⅡ，放入水浴鍋10min。</p><

30、;p>　　將管內(nèi)的溶液轉(zhuǎn)移到帶有離心柱的收集管內(nèi)，放置2 min，之后10000 rpm離心1min，棄去外套管內(nèi)的廢液。</p><p>　　加入500 μl的wash solution，10000 rpm離心1min，棄去外套管內(nèi)的廢液。</p><p>　　重復(fù)上述步驟之后倒掉外套管內(nèi)的廢液后離心10000 rpm離心30 s，打開(kāi)蓋子，在溫室下晾干10 min。</p&

31、gt;<p>　　將離心柱放入Eppendorf管中，加入40 μl的已經(jīng)預(yù)熱的Elution Buffer。</p><p>　　放置2 min后，10000 rpm離心1min后放置-20℃冰箱中保存。</p><p><b>　　連接</b></p><p>　　使用pMD19-T Vector（TaKaRa，日本）進(jìn)行連接

32、反應(yīng)，4℃連接過(guò)夜。反應(yīng)體系如下：</p><p>　　大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備</p><p>　　取-70 ℃甘油保存的DH5α菌種20 μl，接種于20 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃下220-250 rpm振蕩過(guò)夜。</p><p>　　取上述菌液20 μl，接種于20 ml LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下220-250 rpm振蕩2.5-4 h，至O

33、D800=0.5-0.6。取上述菌液1 ml于無(wú)菌Eppendorf管中，蓋上蓋，4℃下5000 rpm離心5 min。</p><p>　　去上清，吸干管底殘留的LB培養(yǎng)基，用4℃冰浴預(yù)冷的CaCl2（0.1 M）溶液400 μl重懸菌體，用移液槍混勻。</p><p>　　置于4 ℃培養(yǎng)箱，冰浴30 min。</p><p>　　4 ℃下4000 rpm離心10

34、 min，徹底去上清，用200 μl CaCl2（0.1 M，預(yù)冷）重懸菌體，用移液槍輕輕混勻。</p><p>　　置于冰浴2-7 h可用于轉(zhuǎn)化。</p><p><b>　　轉(zhuǎn)化</b></p><p>　　使用自制的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。</p><p>　　無(wú)菌條件下，取10 μl連接產(chǎn)物，加入20

35、0 μl大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用槍頭輕輕混勻（冰上操作）。</p><p>　　4 ℃冰浴30 min。</p><p>　　42 ℃精確熱激90 s。</p><p>　　立即轉(zhuǎn)入冰水中冰浴1-2 min后，恢復(fù)到室溫。</p><p>　　加入800 μl無(wú)抗生物L(fēng)B培養(yǎng)基，混勻。</p><p>　　將E

36、ppendorf管置于三角瓶中，37℃恒溫?fù)u床 180 rpm振蕩培養(yǎng)2 h。</p><p>　　室溫下5000 rpm離心4 min，吸去上清900 μl，余下100 μl液體重懸菌體。</p><p>　　將菌液加入37 ℃預(yù)熱的LB固體培養(yǎng)基（40 μg/ml CAB），涂布至干。</p><p>　　將培養(yǎng)基倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12-24 h。

37、</p><p>　　陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定</p><p>　　無(wú)菌條件下，隨機(jī)挑取4個(gè)單菌落分別接種于4個(gè)裝有1 ml LB液體培養(yǎng)基（40 μg/ml CAB）的Eppendorf管中。</p><p>　　置于37℃恒溫?fù)u床，180 rpm振蕩培養(yǎng)4 h。</p><p>　　進(jìn)行菌液PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。建立

38、PCR反應(yīng)體系如下：</p><p><b>　　反應(yīng)程序如下：</b></p><p>　　pMD19-EGFP質(zhì)粒的抽提</p><p>　　打開(kāi)水浴鍋，將Elution Buffer預(yù)熱至60 ℃。</p><p>　　將solution Ⅰ放在冰上。</p><p>　　從每管中分別取1m

39、l 菌液，12，000 rpm離心2 min 收集菌體，倒盡或吸干培養(yǎng)基。</p><p>　　在菌體沉淀中加入250 μl SolutionⅠ，吸打至徹底懸浮菌體。</p><p>　　加入250μl Solution Ⅱ，并將Eppendorf管橫放在食指上，立即溫和顛倒10次至充分混勻。</p><p>　　加入250μl Solution Ⅲ，立即溫和顛倒混

40、勻10次，方法與（5）一樣。</p><p>　　12，000 rpm離心10 min。</p><p>　　將上清全部小心移入吸附柱，8，000 rpm 離心30 s，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。</p><p>　　向吸附柱中加入500μl Wash Solution，10，000 rpm 離心1min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)

41、收集管中。</p><p><b>　　重復(fù)步驟8一次。</b></p><p>　　將空吸附柱和收集管放入離心機(jī)，12，000 rpm 離心2 min。</p><p>　　將吸附柱放入干凈的1.5 ml Eppendorf管中，在吸附膜中央加入50 μl Elution Buffer，室溫靜置2 min，10，000 rpm 離心1 min

42、，將所得到的質(zhì)粒DNA溶液置于-20 ℃保存。</p><p>　　重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP的構(gòu)建及鑒定</p><p>　　pMD19-EGFP質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切反應(yīng)體系如下：</p><p>　　反應(yīng)條件為37℃水浴6h，將pET-28a質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切反應(yīng)體系如下：</p><p>　　

43、反應(yīng)條件為37℃水浴6h。將所有酶切產(chǎn)物置于65°C的水浴鍋中30min之后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。紫外燈下切膠回收，在SolutionⅠ作用下，4℃連接過(guò)夜，連接體系如下，得到的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-EGFP。</p><p>　　連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素（40 μg/ml）的培養(yǎng)基上挑陽(yáng)性克隆擴(kuò)增，鑒定。擴(kuò)大培養(yǎng)12h之后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。再轉(zhuǎn)化至

44、大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上挑陽(yáng)性克隆擴(kuò)增，經(jīng)EcoR I、Nde I雙酶切鑒定和PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同目的基因EGFP克隆時(shí)的擴(kuò)增條件(重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP的構(gòu)建見(jiàn)圖1)。</p><p>　　圖1 重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP的構(gòu)建圖</p><p>　　Fig.1　The construction of recombinant

45、plasmid pET-28a-EGFP</p><p>　　轉(zhuǎn)EGFP基因大腸桿菌的獲得及原核表達(dá)條件的研究 </p><p>　　取10μl 重組質(zhì)粒加入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化菌液涂布含卡那霉素的平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。篩選大腸桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR擴(kuò)增及鑒定。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)之后，保存含有EGFP基因的陽(yáng)性克隆。將轉(zhuǎn)EGFP基因大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，

46、37℃培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜培養(yǎng)物接入LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，在誘導(dǎo)0，1，2，3，4，5 h后離心收集菌體沉淀，并置于長(zhǎng)波紫外線下照射，觀察細(xì)胞中綠色熒光的表達(dá)。</p><p><b>　　結(jié)果與分析</b></p><p>　　目的基因EGFP編碼片段的克隆</p><p>　　以質(zhì)粒pFGC-EGF

47、P為模板，用引物擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳，在750 bp處有單一的擴(kuò)增條帶（圖2），與EGFP編碼序列長(zhǎng)度相符合，將其命名為EGFP。</p><p>　　圖2 EGFP編碼片段電泳圖</p><p>　　1. DL2000 Marker 2. EGFP基因片段</p><p>　　Fig.2 Electrophoresis analysis

48、 of PCR products of EGFP gene</p><p>　　1. DL2000 Marker 2. Fragments of EGFP gene</p><p>　　pMD19-EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定</p><p>　　將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠中回收后，與pMD19-T載體以Solution I 4℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株DH5α

49、，在含有羧芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取白色菌落通過(guò)PCR驗(yàn)證，獲得EGFP基因目的條帶750bp（圖3.1），擴(kuò)大培養(yǎng)12h之后抽提質(zhì)粒，通過(guò)限制性內(nèi)切酶Nde I、EcoR I進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，得到750bp 的EGFP小片段（圖3.2），成功構(gòu)建 pMD19-EGFP質(zhì)粒。</p><p>　　圖3.1 PCR鑒定pMD19-EGFP質(zhì)粒 圖3.2 雙酶切鑒定pMD19-EGF

50、P質(zhì)粒</p><p>　　1. DL2000 Marker 2,3. EGFP基因片段 1. DL2000 Marker 2. EGFP基因片段</p><p>　　Fig.3.1 Identification of pMD19-EGFP plasmid by PCR Fig.3.2 Identification of pMD19-EGFP

51、 plasmid by </p><p>　　1. DL2000 Marker 2,3. Fragments of EGFP gene restrictive enzyme digestion </p><p>　　1. DL2000 Marker 2. Fragments of EGFP gene</p><p>　　重

52、組質(zhì)粒pET-28a-EGFP的構(gòu)建和鑒定</p><p>　　將pET-28a和pMD19-EGFP質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切，分別回收大小片段之后將其連接，構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒命名pET-28a-EGFP，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，分別以PCR法和限制性內(nèi)切酶Nde I、EcoR I進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)該片段約750 bp，與預(yù)期值相符合（圖4）。</p>&l

53、t;p>　　圖4重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP的PCR和雙酶切鑒定</p><p>　　1. DL2000 Marker 2. 未酶切重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP</p><p>　　3. EGFP基因片段 4. NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP</p><p>　　Fig.4 Identification of reco

54、mbinant plasmid by PCR and restrictive enzyme digestion</p><p>　　1. DL2000 Marker 2. pET-28a-EGFP plasmid</p><p>　　3. Fragments of EGFP gene 4. pET-28a-EGFP plasmid digested with NdeⅠand EcoRⅠ

55、</p><p>　　轉(zhuǎn)EGFP基因的大腸桿菌原核表達(dá)條件的研究</p><p>　　轉(zhuǎn)EGFP基因大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，分別在0，1，2，3，4，5 h時(shí)離心取菌液沉淀，經(jīng)長(zhǎng)波紫外線照射后，肉眼可見(jiàn)明亮的綠色熒光。結(jié)果表明（圖5），隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，菌體發(fā)出的熒光量度也逐漸增加，說(shuō)明IPTG誘導(dǎo)EGFP的表達(dá)量是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。</p><p>　

56、　圖5 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后EGFP基因在大腸桿菌BL21中表達(dá)</p><p>　　Fig.5 Expression of EGFP protein in Escherichia coli cells in the induction of IPTG</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　綠色熒光蛋白的表達(dá)不受宿主范圍

57、的限制，也沒(méi)有細(xì)胞種類和部位的限制，因此我們采用技術(shù)較為成熟的大腸桿菌作為EGFP的宿主細(xì)胞。大腸桿菌是最為常見(jiàn)的表達(dá)蛋白的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，它有繁殖速度快，操作簡(jiǎn)單，容易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它的基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過(guò)細(xì)菌總蛋白的50%。因此，它非常適合作為表達(dá)EGFP的宿主。</p><p>　　將EGFP編碼序列克隆至原核表達(dá)載體pET-28a上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL2

58、1，IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間后，經(jīng)紫外照射，菌體呈明亮的綠色熒光，且不同的誘導(dǎo)時(shí)間下菌體發(fā)出的熒光強(qiáng)度有所區(qū)別，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP，并且EGFP在大腸桿菌中得到高效的表達(dá)。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)pMD19-EGFP和pET-28a質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切時(shí)，酶切體系中各成分的含量也會(huì)影響酶切的效率。同時(shí)，在大小片段的連接過(guò)程中我們也發(fā)現(xiàn)，體系中各成分含量的不同也有一定的影響。

59、本實(shí)驗(yàn)中酶切和連接體系中各成分的含量只能作為參考，并不是最佳的濃度。另外，從大腸桿菌BL21中提取質(zhì)粒時(shí)發(fā)現(xiàn)，增加菌液用量對(duì)提取結(jié)果影響幾乎沒(méi)有影響，提取的質(zhì)粒用于雙酶切之后條帶較暗，亮度較低，這可能是由于大腸桿菌BL21是表達(dá)宿主，不適合用于保存以及提取質(zhì)粒。</p><p>　　氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）、β-半乳糖苷酶基因（LacZ）、熒光素酶基因是目前最為常用的報(bào)告基因，但實(shí)驗(yàn)室最為常用的是β-半乳糖苷酶

60、基因，它檢測(cè)的時(shí)候需要加入一些外源底物，當(dāng)其與外源基因融合后一般需要多次純化蛋白的步驟才能檢測(cè)外源基因的表達(dá) [20]。同以往常用的報(bào)告基因相比，GFP優(yōu)勢(shì)非常明顯，它的檢測(cè)不需要任何外源性底物和輔助因子，無(wú)毒、穩(wěn)定、無(wú)污染，而且可以在紫外或藍(lán)光激發(fā)下直接觀察[21,22]。新的研究表明，它是一個(gè)良好的細(xì)胞間信號(hào)傳遞的動(dòng)態(tài)熒光標(biāo)記分子，既具有敏感的標(biāo)記檢測(cè)率，又沒(méi)有放射性的危害，可以跟蹤觀測(cè)第二信使；作為報(bào)告基因，它是能在活細(xì)胞中表達(dá)的

61、發(fā)光蛋白，其作用是任何其它酶類報(bào)告蛋白無(wú)法比擬的[23,24]。在檢測(cè)時(shí)經(jīng)紫外照射，肉眼便可見(jiàn)菌體沉淀發(fā)出綠色熒光，能夠直觀，及時(shí)地反映蛋白的表達(dá)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)之后，表達(dá)EGFP的大腸桿菌生長(zhǎng)情況良好，說(shuō)明EGFP對(duì)宿主細(xì)胞沒(méi)有毒性，誘導(dǎo)之后的大腸桿菌能長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)綠色熒光，說(shuō)明EGFP的熒光性質(zhì)穩(wěn)定，不容易猝滅。</p><p>　　在構(gòu)建原核表達(dá)載體的研究中，陸惠萍等利用GFP基因(GFP-S65T)構(gòu)建載體

62、，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)其在大腸桿菌中的表達(dá)[25]，段斯亮等利用EGFP構(gòu)建原核表達(dá)載體，也是先通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白的分子量再通過(guò)紫外照射檢測(cè)EGFP在大腸桿菌中的表達(dá)[26]。本實(shí)驗(yàn)省去了SDS-PAGE電泳檢測(cè)EGFP蛋白的分子量，大大地提高了蛋白檢測(cè)的效率。利用EGFP作為篩選標(biāo)記可用于載體的構(gòu)建及鑒定[27]。EGFP的相對(duì)分子質(zhì)量較小，其活性形式為單體，是一種十分理想的報(bào)告蛋白與標(biāo)記物，且EGFP與其他蛋白

63、的融合表達(dá)已有很多成功的例子[28,29]。因此，EGFP在原核表達(dá)系統(tǒng)中可以作為一個(gè)很好的報(bào)告基因。</p><p>　　雖然綠色熒光蛋白基因有著許多其他報(bào)告基因無(wú)法具有的優(yōu)點(diǎn)，但在目前看來(lái)仍有不足。由于它的熒光反應(yīng)不是酶反應(yīng)，當(dāng)細(xì)胞本身還存在一些可以受藍(lán)光激發(fā)和產(chǎn)生綠色熒光的物質(zhì)，或者GFP表達(dá)頻率不高的情況下，GFP必須在宿主細(xì)胞中大量地表達(dá)，才有可能使檢測(cè)的結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生較大的偏差，否則會(huì)使檢測(cè)產(chǎn)生一些假相

64、，不易對(duì)熒光進(jìn)行定量的測(cè)量。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP，并使其在大腸桿菌細(xì)胞中得到了高效的表達(dá)，但對(duì)其作為報(bào)告基因還有哪些好處則需進(jìn)一步的研究。</p><p><b>　　結(jié)論</b></p><p>　　（1）通過(guò)PCR擴(kuò)增EGFP目的片段，并將其與pMD19 T-Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌

65、DH5α，篩選陽(yáng)性克隆， PCR和雙酶切法驗(yàn)證，成功構(gòu)建pMD19-EGFP質(zhì)粒。</p><p>　?。?）將pMD19-EGFP與pET-28a質(zhì)粒用Nde I、EcoRⅠ同時(shí)進(jìn)行雙酶切，回收大、小片段之后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆并鑒定，擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，篩選陽(yáng)性克隆，通過(guò)PCR和雙酶切法驗(yàn)證，成功構(gòu)建pET-28a-EGFP質(zhì)粒。</p><p&g

66、t;　?。?）將轉(zhuǎn)EGFP基因的大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在誘導(dǎo)的0h，1h，2h，3h，4h，5h收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，并置于長(zhǎng)波紫外線下照射，觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)量。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，細(xì)菌培養(yǎng)物在長(zhǎng)波紫外線照射下發(fā)出明亮的綠色熒光。</p><p>　　唐孝青, 李斌, 伍小兵, 等. 綠色熒光蛋白及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, (1): 123~124

67、.</p><p>　　段青, 王倩, 祁慶生. 綠色熒光蛋白在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用[J]. 生命的化學(xué), 2007, 27(1): 48~51.</p><p>　　余林輝, 姚偉, 段真珍, 等. 綠色熒光蛋白及其在農(nóng)作物研究中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(36): 15788~15790, 15801.</p><p>　　汪恒英, 周守標(biāo),

68、 常志州, 等. 綠色熒光蛋白(GFP)研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù), 2004, 14(3): 70～73.　　</p><p>　　吳瑞, 張樹(shù)珍. 綠色熒光蛋白及其在植物分子生物學(xué)中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種, 2005, 3(2): 240～244.　</p><p>　　Alkaabi K M, Yafea A, Ashraf S S. Effect of pH on therm

69、al-and chemical-induced denaturation of GFP[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2005, 126(2): 149~156. </p><p>　　Marek H, Slavom R, Vladislav C. Green fluorescent protein as a vital marker for nondes

70、tructive detection of transformation events in transgenic plants[J] . Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2006, 86(3): 303~318.</p><p>　　劉艷麗, 魯澄宇. 綠色熒光蛋白的特性及其在藥學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 藥物生物技術(shù), 2009, 16(2): 170～174.</

71、p><p>　　Baulcombe D C, Chapman S, Cruzs S. Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infections[J]. The Plant Journal, 1995, 7: 1045~1053.</p><p>　　KÖhler R H, Cao J, Zipfel

72、W R, et al. Exchange of protein molecules through connections between higher plant plastids[J]. Science, 1997, 276: 2039~2042.</p><p>　　Argueta C, Yuksek K, Summers M. Construction and use of GFP reporter ve

73、ctors for analysis of cell-type-specific gene expression in Nostoc punctiforme[J]. Journal of Microbiological Methods, 2004, (59): 181~188.</p><p>　　Jain S, Teotia S, Gupta M N. Purification of green fluores

74、cent protein overexpressed by a mutant recombinant Escherichia coli[J]. Protein Expression and Purification, 2004, (36): 76~81.</p><p>　　孫麗萍, 胡巢鳳, 周羽竝. 人NOD2基因啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 現(xiàn)代免疫學(xué), 2008, 28(3): 219~22

75、3. </p><p>　　姜伯樂(lè), 趙宇, 劉建元, 等. 含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告子的載體系統(tǒng)的構(gòu)建[J]. 廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué), 2008, 27(4): 343~348.</p><p>　　何淑雅，馬云，楊陽(yáng)，等. FXR1基因與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白融合載體的構(gòu)建及表達(dá)[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9(7): 1265~1267.</p><p>　

76、　張?chǎng)H, 馬媛媛, 鄒少蘭. 大腸桿菌雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體中綠色熒光蛋白表達(dá)水平的研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2009, (5): 60~63.</p><p>　　蔣芳玲, 楊國(guó)順, 劉志敏, 等. 綠色熒光蛋白研究進(jìn)展[J]. 作物研究, 2003, 17(2): 106～109.</p><p>　　黃國(guó)存, 朱生偉, 董越梅, 等. 綠色熒光蛋白及其在植物研究中的應(yīng)用[J]. 植物學(xué)

77、報(bào), 1998, 15(5): 24~30.</p><p>　　朱學(xué)良, 單永立, 李艷. 綠色熒光蛋白——照亮生命科學(xué)的一盞明燈[J]. 生命科學(xué), 2008, 20(6): 850~855.</p><p>　　Park H K, Zeng C. Construction of an XcmI-generated T vector bearing green fluorescent

78、protein marker for direct cloning of PCR products [J]. Anal Biochem, 2007, 360 (1): 144.</p><p>　　張敏, 任慧霞. 報(bào)告基因的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品與藥品, 2007, 9(9): 45~48.</p><p>　　楊慧敏, 李文剛, 吳高鋒, 等. 綠色熒光蛋白的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)

79、畜牧獸醫(yī)(生理生化), 2008, 35(8): 29~32.</p><p>　　王曉麗, 邵衛(wèi)星, 單虎. 綠色熒光蛋白研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2008, 29(1): 56~59.</p><p>　　Spaink H P, Schlaman H R M, Bras C P, et al. Use of GFP to study factors involved in th

80、e lotus japonicus symbiosis[J]. Current Plant Science and Biotechnology in Agriculture, 2006, 38: 219~222.</p><p>　　陸惠萍, 周鳳娟, 孫樹(shù)漢. 綠色熒光蛋白在大腸桿菌中的克隆及高效表達(dá)[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 1997, 18(5): 406~408.</p><p>

81、;　　段斯亮, 于聲, 蘇曉慶. 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J]. 廣西醫(yī)學(xué), 2008, 30(10): 1475~1477.</p><p>　　唐金寶, 陳永, 梁淑娟, 等. 利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因作篩選標(biāo)記克隆載體的構(gòu)建及鑒定[J]. 中國(guó)海洋藥物雜志, 2009, 28(2): 28~31. </p><p>　　Zhang JZ, Guo XB, Xie

82、 SY, et al. Production of transgenic mice carrying green fluorescence protein gene by a lentiviral vector-mediated approach[J]. Prog Nat Sci, 2006, 16(8): 827~833.</p><p>　　薛麗香, 童坦君, 張宗玉. 報(bào)告基因的選擇及其研究趨向[J]. 生