p18基因在大腸桿菌及酵母中的表達(dá)研究.pdf

1、p18基因全長(zhǎng)3232bp，含有2個(gè)外顯子，編碼區(qū)位于第1外顯子內(nèi)編碼522bp，GC含量高達(dá)90％。以往研究表明，p18基因與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。生物信息學(xué)分析，P18蛋白分子量約18.9kD，存在4次跨膜的結(jié)構(gòu)域。通過(guò)膠體金定位分析，確定P18蛋白亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。由于p18基因編碼區(qū)高GC含量和P18蛋白的高疏水性，p18基因的可溶性表達(dá)存在著很大的困難。
　　本研究根據(jù)生物信息學(xué)分析P18蛋白的疏水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)特

2、點(diǎn)，構(gòu)建了p18基因不同的截短體，嘗試p18基因截短體的可溶性表達(dá)。根據(jù)外源基因與一些易表達(dá)的序列共翻譯能大幅提高表達(dá)水平，將目的基因構(gòu)建到谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GST）融合表達(dá)的載體中形成重組體，在大腸桿菌和酵母中摸索最佳表達(dá)條件，最終表達(dá)出攜帶目的蛋白的GST融合蛋白。進(jìn)一步利用谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入重組體pGEX-6P-1-p18-280、pGEX-6P-1-p18-397、pGEX-

3、6P-1-p18-433的大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株在37℃、1mMIPTG濃度下能夠大量表達(dá)，但經(jīng)可溶性分析得知，這些表達(dá)的蛋白絕大部分為包涵體。優(yōu)化誘導(dǎo)條件后，轉(zhuǎn)入上述重組體的大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株在16℃、0.1mMIPTG濃度下獲得了可溶性表達(dá)。轉(zhuǎn)入重組體pYES2-GST-p18的酵母INVSc1在30℃、2％半乳糖誘導(dǎo)72h條件下，經(jīng)純化也得到了可溶性的GST-P18融合蛋白，但其表達(dá)量遠(yuǎn)沒(méi)有在大腸桿