酵母甘油合成關(guān)鍵酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)研究.pdf

1、酵母中普遍存在葡萄糖到甘油代謝途徑，對(duì)釀酒酵母的研究表明，葡萄糖分解生成磷酸二羥丙酮(DHAP)，DHAP在關(guān)鍵酶NAD+依賴性3-磷酸甘油脫氫酶(GPD)催化下還原為3-磷酸甘油。3-磷酸甘油在3-磷酸甘油酯酶(GPP)的作用下脫磷酸根而形成甘油。這兩個(gè)酶分別有兩個(gè)同工酶，其中GPD1和GPP2受滲透壓誘導(dǎo)高表達(dá)。
　　 產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5具有耐高滲且高產(chǎn)甘油的特性，本課題組已通過(guò)染色體步移法首次成功克隆了來(lái)源于產(chǎn)

2、甘油假絲酵母的胞漿3-磷酸甘油脫氫酶編碼基因CgGPD1，通過(guò)基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因是全新的基因，有關(guān)該酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究未見(jiàn)報(bào)道，為了能更好的解釋該酶在高滲條件下保持高酶活和產(chǎn)甘油假絲酵母的耐高滲甘油合成的代謝機(jī)理，因此對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究顯得十分迫切。
　　 在前期研究的基礎(chǔ)上，首先，本課題以產(chǎn)甘油假絲酵母基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到3-磷酸甘油脫氫酶編碼基因CgGPD1，將其克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)上

3、，在E.coliBL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，利用表達(dá)載體pET-28a(+)上的6His·Tag標(biāo)記選用N12+柱純化具有表達(dá)活性的3-磷酸甘油脫氫酶(CgGPD1)，純化后比酶活達(dá)到152.6mU/mg，并初步研究了該酶的酶學(xué)性質(zhì)并與釀酒酵母3-磷酸甘油脫氫酶ScGPD1的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了比較。研究發(fā)現(xiàn):兩種蛋白分子量大小基本相同，CgGPD1的最適pH為6.2，而ScGPD1為6.8；CgGPDl在pH3.5-7.5范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好

4、，ScGPD1在pH4.5-6.2范圍內(nèi)穩(wěn)定；CgGPD1最適溫度為25℃，ScGPD1為37℃；二者均在-20℃表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性；CgGPD1受Mg2+激活明顯，受Zn2+完全抑制，進(jìn)一步通過(guò)在產(chǎn)甘油假絲酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中單獨(dú)添加這兩種離子來(lái)指導(dǎo)甘油發(fā)酵，ScGPD1同樣受Mg2+激活，受Zn2+完全抑制；以DHAP為底物CgGPD1的Km值為0.55mmol/L，Vmax為1.06umol/(mg/nun)，ScGPD1的Km值為0

5、.75mmol/L，Vmax為0.51umol/(mg/min)。
　　 其次，本研究從釀酒酵母中擴(kuò)增了3-磷酸甘油酯酶編碼基因GPP2(ScGPP2)，構(gòu)建重組菌株pET28a-ScGPP2/BL21，在大腸桿菌中對(duì)ScGPP2進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化和酶學(xué)性質(zhì)的初步研究。研究發(fā)現(xiàn)，ScGPP2大小約為31KDa，最適pH為4.5，在pH5.5-7.5范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性；最適溫度為55℃，在4℃和-20℃均有較好的穩(wěn)定性，受到M

6、g2+和Fe3+的激活，而Zn2+、Sn2+、Mn2+離子對(duì)該酶呈完全抑制狀態(tài)；以不同濃度的3-磷酸甘油為底物，測(cè)得該酶的Km值為0.55mmol/L，Vmax為0.30umol/(mg/min)。以3-磷酸甘油為底物，進(jìn)行菌株pET28a-ScGPP2/BL21的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，證明了該酶良好的轉(zhuǎn)化性能，該酶能有效的將底物3-磷酸甘油轉(zhuǎn)化為甘油。
　　 最后，我們?cè)诖竽c桿菌中嘗試了葡萄糖到甘油代謝途徑的重構(gòu)。即將基因CgGPD1和