抗感染新靶點(diǎn)分選酶A基因在大腸桿菌中的克隆表達(dá)與鑒定.pdf

1、革蘭氏陽(yáng)性菌的表面蛋白有助于病原菌吸附在宿主組織上，侵入宿主細(xì)胞，并躲避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，在病原菌感染宿主過(guò)程中具有重要作用。表面蛋白主要通過(guò)一種叫分選酶的轉(zhuǎn)肽酶的催化作用，而錨定到細(xì)胞壁上。金黃色葡萄球菌分選酶基因缺失突變株失去錨定表面蛋白的能力，而不能感染宿主。因此，分選酶有望成為抗感染新型靶酶。
　　 本研究利用GenBank中的分選酶A基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得618

2、bp的DNA片段。利用TA克隆技術(shù)，PCR產(chǎn)物插入T載體中構(gòu)建得到重組載體pMD20-srtA和pMD19-srtA。按常規(guī)分子克隆技術(shù)最終成功構(gòu)建兩種原核表達(dá)載體pet22-srtA和pTRX-srtA，測(cè)序結(jié)果業(yè)已遞交到GenBank中，登錄號(hào)分別是FJ439573和FJ439574。
　　 兩種重組表達(dá)載體通過(guò)化學(xué)方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)BL21（DE3）中，在1mmol/LIPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。利用SDS-PADE和we

3、stern blot進(jìn)行鑒定和分析，結(jié)果顯示：重組載體pet22-srtA和pTRX-srtA分別表達(dá)出相對(duì)分子量為約45kDa和39kDa的外源蛋白；在重組質(zhì)粒pet22-srtA中分選酶基因主要以包涵體形式表達(dá)；在重組質(zhì)粒pTRX-srtA中分選酶基因?qū)崿F(xiàn)可溶性表達(dá)，說(shuō)明分子伴侶硫氧還蛋白（Trx）有利于分選酶基因的原核表達(dá)。利用融合蛋白的組氨酸標(biāo)簽，通過(guò)親和層析對(duì)重組分選酶A蛋白進(jìn)行純化，純度達(dá)到90％左右。
　　 本研究