惡臭假單胞菌海藻糖合酶基因在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、海藻糖具有非常重要生物學(xué)意義的,對(duì)生物大分子起到一定的保護(hù)作用,可以保護(hù)生物免受干燥、高溫、低溫、輻射、高滲等惡劣環(huán)境的傷害,因此具有巨大的市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值。海藻糖的研究興起于日本,后在各國(guó)掀起了研究熱潮。近年來(lái)國(guó)內(nèi)對(duì)海藻糖的研究,主要集中在酵母的抽提和微生物發(fā)酵領(lǐng)域,但在分子生物學(xué)領(lǐng)域才剛剛起步。隨著越來(lái)越多的海藻糖合酶基因公布于眾,海藻糖在分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究越來(lái)越熱。
　　本課題正是使用基因工程手段,通過(guò)對(duì)惡臭假單胞菌海藻

2、糖合酶目標(biāo)基因的克隆和外源載體的高效表達(dá)獲得大量目的蛋白,擺脫了代謝調(diào)控機(jī)制對(duì)海藻糖合酶基因的控制,得到穩(wěn)定的重組菌,使酶量得到顯著提高,酶活相對(duì)增加,為利用該酶轉(zhuǎn)化麥芽糖生成海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定研究基礎(chǔ)。
　　本研究以惡臭假單胞菌P06基因組DNA為模板,通過(guò)PCR技術(shù)、雙酶切、連接載體、導(dǎo)入大腸桿菌BL21(ED3),成功克隆了P06菌株的海藻糖合酶基因。通過(guò)測(cè)序?qū)06海藻糖合酶基因進(jìn)行了分析,并構(gòu)建了P06海藻糖合酶的系

3、統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),說(shuō)明惡臭假單胞菌的海藻糖合酶基因具有一定的同源性和保守性。對(duì)重組菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo),成功表達(dá)目的蛋白。對(duì)基因工程菌進(jìn)行酶活測(cè)定,表明每毫升粗酶液酶活達(dá)到11.84U/mL,每克干菌體的酶活達(dá)到297.6U/g,比原始菌株P(guān)06有較大提高。對(duì)重組菌的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)試,六次傳代后質(zhì)粒丟失率為20％,說(shuō)明構(gòu)建的基因工程菌可穩(wěn)定傳代。
　　對(duì)實(shí)驗(yàn)室搖瓶發(fā)酵時(shí)的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化,然后在此基礎(chǔ)上對(duì)影響酶活的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。最

4、終確定:誘導(dǎo)溫度為25℃,誘導(dǎo)劑添加量為0.6mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為培養(yǎng)至OD600=0.8時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo),誘導(dǎo)時(shí)間為6h;粗酶液反應(yīng)體系中最適pH為7.5,反應(yīng)溫度35℃、體系反應(yīng)2h、底物濃度為30％。在優(yōu)化后的最有條件下,對(duì)樣品海藻糖含量進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。每毫升粗酶液酶活力為318.12U/mL。
　　通過(guò)對(duì)5L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)條件的探索,采用流加葡萄糖和氮源的方式可以大大延長(zhǎng)對(duì)數(shù)期并且增加菌體收得率,發(fā)酵總時(shí)長(zhǎng)21h,保