酵母菌谷胱甘肽高產(chǎn)基因在大腸桿菌里的表達(dá).pdf

1、谷胱甘肽,即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸,是一種分布較為廣泛,在生物體內(nèi)有重要作用的活性物質(zhì)。在食品,醫(yī)療,美容等領(lǐng)域有廣闊的前景,越來越受到人們的重視。目前,在生產(chǎn)中主要采用的發(fā)酵法還存在一些問題,如常用的工業(yè)酵母谷胱甘肽產(chǎn)量較低。因此設(shè)法獲得性狀優(yōu)良的發(fā)酵用菌株無疑將會(huì)是一個(gè)較好的方向。近年來,分子研究的飛速發(fā)展和展現(xiàn)出來的優(yōu)勢(shì)使其成為育種研究的一個(gè)新手段,谷胱甘肽合成過程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶的序列為基因工程探索提供了極大的便利。<

2、br>　　 本文從工業(yè)發(fā)酵常用的釀酒酵母菌出發(fā),通過前期培養(yǎng)挑取10株生長(zhǎng)狀況較好且產(chǎn)量較高的菌株作為出發(fā)菌,其中A3和A8于發(fā)酵30h時(shí)測(cè)得GSH含量分別為23.1mg/和29.82mg/L,A3菌株的干細(xì)胞含量達(dá)11.38mg/g,極具誘變潛力,故選擇A3進(jìn)行誘變,紫外誘變后得到的高產(chǎn)菌A39的GSH量提高至31.41mg/L,較出發(fā)菌高出36%且遺傳穩(wěn)定。經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn),該高產(chǎn)菌為釀酒酵母。通過PCR從A39的基因組里提取到γ-

3、L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸合成酶的編碼基因gshⅠ,電泳知其長(zhǎng)度約為2100左右,送由上海生工測(cè)序,結(jié)果顯示其與gene-bank里登錄的gshⅠ同源性高達(dá)98%,而后將該基因片段連接至克隆載體PUCm-T上,成功構(gòu)建了PUCm-T-gshⅠ,通過藍(lán)白斑篩選出陽性克隆,將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中,誘導(dǎo)后簡(jiǎn)單測(cè)量了重組菌的GSH含量,結(jié)果顯示,GSH含量相較對(duì)照菌提高了29.4%。
　　 主要研究結(jié)果如下:
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4、.通過篩菌得到一株GSH含量占菌體干重11.38mg/g的菌株A3,而后將其誘變使產(chǎn)量提高了36.1%,經(jīng)過傳代培養(yǎng),A39表現(xiàn)出穩(wěn)定的產(chǎn)GSH能力。
　　 2.依據(jù)酵母菌鑒定手冊(cè)對(duì)A39進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示該菌為釀酒酵母。
　　 3.利用試劑盒成功的提取到A39的基因組DNA,并通過PCR方法將編碼谷胱甘肽合成的關(guān)鍵酶gshⅠ擴(kuò)增出來,并測(cè)序。
　　 4.成功的構(gòu)建了PUCm-T-gshⅠ載體,并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌