基于納米材料的大腸桿菌檢測及抗菌肽遞送系統(tǒng)的研究.pdf

1、本論文基于納米材料在高靈敏度檢測與藥物遞送方面應(yīng)用，首先將納米金與分子信標(biāo)結(jié)合，設(shè)計一種可以快速、靈敏、特異性檢測尿道病原菌的納米金DNA探針;接著將納米材料介孔二氧化硅與連接腫瘤細(xì)胞靶向肽的抗菌肽RGD-hylina1結(jié)合，實現(xiàn)pH依賴的抗菌肽釋放，從而達(dá)到減毒增效的目的。研究包括以下三個方面的內(nèi)容:
　　1.納米金DNA探針快速靈敏檢測大腸桿菌研究
　　本文基于納米材料設(shè)計了一種納米金分子探針用于提高尿道病原菌檢測的效率

2、和靈敏度。本研究為達(dá)到快速靈敏檢測尿道病原菌的目的，根據(jù)細(xì)菌保守通用16SrRNA設(shè)計DNA分子探針。檢測原理為當(dāng)無目標(biāo)序列存在的情況下該探針通過尾部互補序列形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，處于尾部的熒光分子FAM被臨近淬滅基團(tuán)BHQ1所淬滅;當(dāng)目標(biāo)序列出現(xiàn)后，頸環(huán)結(jié)構(gòu)被打開，F(xiàn)AM遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，產(chǎn)生熒光，根據(jù)熒光強度判斷目標(biāo)序列濃度。本研究首先制備納米金，通過紫外分光光度計與TEM對納米金進(jìn)行表征;然后將DNA探針富集到13nm納米金表面，通過DLS檢

3、測連接情況;接著對比DNA探針與納米金DNA探針檢測大腸桿菌靈敏度;同時設(shè)計目標(biāo)序列、4個錯配堿基序列、完全不相關(guān)序列及不相關(guān)3008bp DNA質(zhì)粒檢測DNA探針與納米金DNA探針特異性;病人尿液樣本檢測DNA探針與納米金DNA探針對尿路感染病原菌靈敏性;最后研究納米金DNA探針在血清環(huán)境中對大腸桿菌檢測能力，分析納米金DNA探針抗干擾性。結(jié)果顯示:本研究制備的納米金具有較均一的粒徑，并且DNA探針與納米金成功連接;通用對熒光強度的檢

4、測，證明該納米金DNA探針可以在1h內(nèi)檢測102cfu/ml E.coli，靈敏度是單獨使用DNA探針的103倍;同時DNA探針與納米金DNA探針均具有較強特異性和抗干擾性(P＜0.04)。結(jié)果表明:本研究首次以DNA納米探針進(jìn)行快速、靈敏度高且特異性強的大腸桿菌檢測，解決傳統(tǒng)檢測方法步驟繁瑣，費用高，時間長的缺點;并且該檢測方法具有易制備、低成本的特點，通過改變DNA探針序列還可以應(yīng)用到動物細(xì)菌、病毒、家畜早孕及食品安全等高靈敏檢測中

5、。
　　2.基于納米材料介孔二氧化硅(HMS-COOH)的載藥系統(tǒng)中靶向抗菌肽序列的研究
　　針對目前腫瘤藥物治療存在毒副作用大的問題，本研究基于納米材料介孔二氧化硅設(shè)計通過PH值依賴藥物釋放的載藥系統(tǒng);首先為尋找新型抗腫瘤及適合介孔二氧化硅運載的藥物，本研究選擇來源于南美樹蛙皮膚中抗菌肽hylin a1，并以抗腫瘤性研究較為成熟的抗菌肽蜂毒素(melittin)做為參照，連接不同特異性的腫瘤細(xì)胞靶向肽SP94與RGD，比較

6、連接前與連接后多肽之間的抗腫瘤性和溶血性差異，從中選擇適合作為介孔二氧化硅運載的靶向抗菌肽;同時研究靶向多肽結(jié)構(gòu)及長度對抗菌肽生物活性影響。結(jié)果顯示:比較melittin、SP94-melittin、RGD-melittin促腫瘤細(xì)胞凋亡性，我們得到RGD-melittin促腫瘤細(xì)胞凋亡性作用最強，其次為melittin，最低為SP94-melittin;比較三者溶血性結(jié)果得到連接有RGD的melittin在0.2、1、2μM處與mel

7、ittin、SP94-melittin相比降低了自身溶血性，具有極顯著差異(P＜0.01)或顯著差異(P＜0.05)，連接有SP94的melittin溶血性與melittin相比差異不顯著(P＞0.05)。據(jù)此我們推測靶向肽的長度、空間結(jié)構(gòu)、特異性會影響多肽活性及功能，因此我們在設(shè)計多功能雜合肽要考慮各肽長度、空間結(jié)構(gòu)、生物活性之間的相互影響。通過上面結(jié)果我們選擇對抗菌肽活性影響較小的RGD與hylin a1進(jìn)行連接，發(fā)現(xiàn)hylin a

8、1與RGD-hylin a1促腫瘤細(xì)胞凋亡性相比無顯著差異(P＞0.05);溶血性研究表明hylin a1與RGD-hylin a1僅在7μM具有顯著差異(P＜0.05，38.7％ vs19.7％)，其他濃度差異均不顯著(P＞0.05)。結(jié)果表明:我們所設(shè)計的RGD-hylin a1抗菌肽適合做為介孔二氧化硅運載的藥物。
　　3.納米材料介孔二氧化硅(HMS-COOH)結(jié)合靶向抗菌肽RGD-hylin a1促腫瘤細(xì)胞凋亡研究

9、>　　基于納米材料可以靶向聚集于腫瘤組織處特點，同時根據(jù)上文對幾種抗菌肽研究選擇RGD-hylin a1作為運載藥物，通過靜電作用負(fù)載于介孔二氧化硅(HMS-COOH)上形成RGD-hylin a1-HMS載藥遞送系統(tǒng)。結(jié)果顯示:本研究選擇的HMS-COOH具有促腫瘤細(xì)胞凋亡性，隨著HMS-COOH濃度增加細(xì)胞凋亡率逐漸提高，但HMS-COOH不具有溶血性。RGD-hylin a1-HMS在pH=7的環(huán)境低濃度6、12.5ug/ml促腫