乳鏈菌肽抗性蛋白(NSR)突變體在大腸桿菌中的表達純化及功能研究.pdf

1、乳鏈菌肽（Nisin）是某些乳酸菌產(chǎn)生的一種陽離子抗菌肽，而Nisin抗性蛋白（Nisin resistance protein，NSR）的表達則使一些非Nisin產(chǎn)生菌獲得Nisin抗性。本實驗室前期研究結(jié)果表明，作為乳酸乳球菌中第一個被鑒定的末端特異性蛋白酶，NSR是通過降解Nisin使其抑菌活性降低來行使Nisin抗性功能的，其降解位點在Nisin分子的MeLan28（Methyllanthionine，甲基羊毛硫氨酸）和Ser2

2、9之間。在此研究基礎(chǔ)上，本文進一步對NSR蛋白的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，包括其核心功能區(qū)降解Nisin活性及與底物Nisin的結(jié)合能力等進行了研究，為深入了解和闡明NSR作為一種末端特異性蛋白酶行使Nisin抗性的作用機制奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究首先是確定NSR行使體外降解Nisin功能的核心功能區(qū)域。在對NSR蛋白進行同源序列分析以及二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)比對的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了不同結(jié)構(gòu)域缺失的NSR與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathio

3、ne-S-transferase，GST）的融合表達載體NSR-TSP、NSR△94、NSR△78、NSR△67、NSR△38，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E． coli BL21。經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl1-thio-β-D-galactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析顯示各表達產(chǎn)物均以部分可溶形式存在。經(jīng)過谷胱甘肽（GSH）親和柱層析、PreScission蛋白酶切后最終獲得電泳純的NSR不

4、同結(jié)構(gòu)域缺失突變體蛋白。進而通過體外反應(yīng)系統(tǒng)，檢測了各突變體體外降解Nisin的生物功能。反應(yīng)產(chǎn)物抑菌活性測定結(jié)果表明被NSRA38作用后的Nisin喪失了抑菌活性，而被NSR-TSP、NSR△94、NSR△78、NSR△67作用后的Nisin沒有喪失抑菌活性；反相高效液相層析（RP-HPLC）分析結(jié)果進一步表明這是由NSR△38具備Nisin降解活性所造成的，而突變體NSR-TSP、NSR△94、NSR△78、NSR△67則不具備Ni

5、sin降解活性。
　　 為進一步分析NSR不同功能區(qū)識別結(jié)合底物Nisin的能力，采用相同策略，分別構(gòu)建了NSR△94、NSR△78、NSR△67、NSR△38第236位絲氨酸突變的截短突變體，并在大腸桿菌中實現(xiàn)了GST融合表達，經(jīng)過GSH柱層析、PreScission蛋白酶切后獲得電泳純不具降解活性的突變體蛋白。利用表面等離子共振技術(shù)（SPR）分別檢測了NSRs△27、NSRs△38、 NSRs△94突變體在體外對Nisin的