酵母SUMO和SUMO蛋白酶在大腸桿菌中的高效表達.pdf

1、酵母小泛素相關(guān)修飾蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)作為融合標簽廣泛用于提高異源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達，而SUMO蛋白酶ULP可用于高效去除SUMO標簽。目前，酵母SUMO與ULP在大腸桿菌中表達量較低，限制了該系統(tǒng)的應用。本文通過密碼子優(yōu)化合成了大腸桿菌密碼子偏愛的酵母 SMT3和 ULP編碼基因，分析了密碼子優(yōu)化對合成基因表達和活性的影響以及啟動子對合成型ULP表達的影響。得到如

2、下結(jié)果：
　　1.構(gòu)建了含His6標簽的SUMO和ULP合成型基因(sumo(S)、ulp(S))的原核表達載體，實現(xiàn)了兩種合成基因在大腸桿菌中的表達。
　　2.分析了密碼子優(yōu)化對 SUMO融合蛋白表達水平的影響，密碼子優(yōu)化可以提高SUMO融合蛋白表達水平，但不一定能改善蛋白折疊。
　　3.分析了啟動子元件對ULP合成基因表達的影響，在pET28b中基因表達產(chǎn)物主要為包涵體，但在pMF載體中的基因表達產(chǎn)物呈現(xiàn)可溶態(tài)，野

3、生型ULP基因表達產(chǎn)物的水溶性不受啟動子元件影響。
　　4.定性定量分析SUMO和ULP合成基因在大腸桿菌的表達，結(jié)果表明合成基因在 BL21(DE3)表達水平要顯著高于野生基因在 BL21(DE3)和 RosettaTM(DE3)中表達量。和野生型蛋白相比，合成基因產(chǎn)物在SDS-PAGE中遷移率改變。
　　5.分析七種蛋白標簽對ULP(S)的表達量和酶切活性的影響，結(jié)果顯示蛋白標簽不能再提高合成ULP產(chǎn)物的表達水平和活性。

4、
　　6.分析ULP對SUMO融合蛋白切割效率，結(jié)果表明野生型SUMO融合底物可以被兩種形式的 ULP完全酶切，但是合成型 SUMO融合底物不能被兩種形式的 ULP完全酶切。
　　7.對ULP(S)進行蛋白純化，經(jīng)Ni-NTA親和層析一步純化，得到純度較高的ULP(S)蛋白酶，產(chǎn)量是已報道的ULP野生型蛋白酶產(chǎn)量三倍。
　　綜上所述，本研究合成的大腸桿菌密碼子偏愛的酵母SMT3和ULP編碼基因在大腸桿菌中均實現(xiàn)了高表達