tatnlsnkx6.2融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)純化及其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響

1、分類號(hào)：Q 7 8密 級(jí)：學(xué)位類別： 科學(xué)學(xué)位囹 專業(yè)學(xué)位口學(xué)校代碼：1 0 0 6 2學(xué) 號(hào)：2 0 1 0 6 0 2 0 1 7學(xué)科門類：理學(xué)夭坪醬科矢垮 T l A N J l NM E D I C A L U N I V E R S I Ⅳ碩士學(xué)位論文M A S T E R ’S D I S S E R T A T I O N論文題目：T A T - N L S ．N k x 6 ．2 融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)純化及其對(duì)神經(jīng)

2、干細(xì)胞分化的影響T IT L E E x p r e s s i o n a n dp u r i f i c a t i o n o fT A T - N L S - N k x 6 ．2f u s i o np r o t e i ni nE ．c o l ia n dt h ee f f e c t so n t h ed i f f e r e n t i a t i o n o fn e u r a ls t e m c e

3、l l s一級(jí)學(xué)科：生物學(xué)二級(jí)學(xué)科：生物化學(xué)與分子生物學(xué)論文作者：張欣指導(dǎo)教師：郭剛研究員導(dǎo)師組成員：張瑞助理研究員王寶利研究員天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二O 一三年五月天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要目的：探討同源盒基因N k x 6 ．2 在因甲狀腺素缺乏導(dǎo)致腦發(fā)育遲滯過程中的分子作用機(jī)制，獲得能穿過血腦屏障的并跨膜進(jìn)入細(xì)胞核的T N - N k x 6 ．2 重組蛋白。本文旨在觀察同源盒基因N k x 6 ．2 對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)分化的影

4、響。為進(jìn)一步深入探討同源盒基因N k x 6 ．2 在甲狀腺減低模型的作用機(jī)制奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：本實(shí)驗(yàn)利用基因克隆技術(shù)，將T A T - N L S ．N k x 6 ．2 基因片段和空質(zhì)粒p E T - 2 8 a分別進(jìn)行雙酶切后，利用T 4 連接酶連接，將T A T - N L S - N k x 6 ．2 及N k x 6 。2 基因克隆入p E T - 2 8 a 表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒p E T - 2 8 a ．T N

5、 ．N k x 6 ．2 及p E T - 2 8 a - N k x 6 ．2 ，并將重組質(zhì)粒p E T - 2 8 a ．T N ．N k x 6 ．2 及p E T - 2 8 a - N k x 6 ．2 轉(zhuǎn)化入克隆菌E ．c o l iD H 5 a 中，再轉(zhuǎn)化至E ．c o l i B L 2 1 ( D E 3 ) 中表達(dá)，經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定重組子，將酶切和測(cè)序正確的重組質(zhì)粒保存于1 0 ％的甘油中，平板劃線，挑取單菌落于抗

6、K a n 的L B 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，按1 ：5 0 接種于抗K a r l 的L B 液體培養(yǎng)基，當(dāng)O D 值為0 ．6 左右時(shí)，用I P T G 誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，并對(duì)誘導(dǎo)條件如誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)溫度，I P T G 濃度進(jìn)行優(yōu)化，S D S ．P A G E 及W e s t e r n B l o t 鑒定融合蛋白，p E T - 2 8 a 載體帶有融合標(biāo)簽H i s ·T a g ，融合標(biāo)簽用于檢測(cè)和純化目的蛋白，經(jīng)

7、組氨酸N i 2 + 親和層析純化融合蛋白。將融合蛋白T N ．N k x 6 ．2 ，N k x 6 ．2 分別以不同濃度與神經(jīng)干細(xì)胞孵育，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)分化后的細(xì)胞類型，抗體分別為N F ．2 0 0 、G F A P 、G a l ．C 。結(jié)果：經(jīng)酶切和測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒p E T - 2 8 a ．T N ．Ⅻ( ) 【6 ．2 及p E T - 2 8 a ．N k x 6 ．2 ，按1 ：5 0 的接種量接入搖

8、瓶，3 7 0 C ，2 5 0 r ／r a i n 培養(yǎng)約4 h ，當(dāng)菌液的O D值為0 ．6 時(shí)，增添終濃度為l m m o l ／L 的誘導(dǎo)劑I P T G 在2 5 。c 誘導(dǎo)8 h 后，融合蛋白的產(chǎn)量最高，能夠在E ．c o l i B L 2 1 ( D E 3 ) 中高效表達(dá)融合蛋白T N ．N k x 6 ．2 ，經(jīng)S D S ．P A G E 電泳分析，結(jié)果顯示目的蛋白的表達(dá)帶的分子量與預(yù)期相符，經(jīng)組氨酸N i 2

9、+ 親和層析純化，得到高純度的融合蛋白，經(jīng)W e s t e r n B l o t 鑒定，純化后的融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，融合蛋白為T N - N k x 6 ．2 和N k x 6 。2 ，融合蛋白T N - N k x 6 ．2 能穿過細(xì)胞膜進(jìn)入神經(jīng)干細(xì)胞影響神經(jīng)干細(xì)胞的分化，經(jīng)熒光顯微鏡觀察G a l ．C 的陽性細(xì)胞超過7 5 ％，有助于向少突膠質(zhì)細(xì)胞方向發(fā)展，尤其以增加2 0 0 } ，t g ／L 、5 0