人EGF-IL-18的表達優(yōu)化、表征鑒定及初步活性研究.pdf

1、目的:
　　 構建EGF-IL-18融合基因的原核表達載體,運用高密度發(fā)酵技術獲得高表達的EGF-IL-18蛋白,進一步通過純化、復性獲得有活性的EGF-IL-18蛋白,為下一步動物體內(nèi)生物學作用研究和臨床前新藥的開發(fā)打下基礎。
　　 方法:
　　 1.EGF-IL-18原核表達載體的構建和表達采用PCR方法,以質(zhì)粒pFUS-EGF-IL-18為模板,擴增EGF-IL-18融合基因并引入C12T、C21T、T24

2、C、A543T、C549T、T552C、A558G同義突變,將其克隆入原核表達質(zhì)粒pET12a(+),構建表達載體pET12a(+)-EGF-IL-18,限制性內(nèi)切酶雙酶切和測序鑒定質(zhì)粒構建是否正確。重組質(zhì)粒轉化E.coli Rosetta(DE3),IPTG誘導表達,SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定表達產(chǎn)物。
　　 2.EGF-IL-18高密度發(fā)酵條件優(yōu)化以及純化復性針對發(fā)酵的pH、誘導溫度、誘導時機、補料等

3、因素,在10L發(fā)酵罐水平的基礎上,采用正交設計的方法優(yōu)化發(fā)酵條件。離心收集發(fā)酵菌液,壓力破碎儀破碎細胞獲得目的蛋白包涵體,采用2M尿素洗滌包涵體,8M尿素溶解包涵體,S-100和DEAE-SFF兩步法純化復性目的蛋白,冰凍干燥保存目的蛋白。
　　 3.EGF-IL-18蛋白表征鑒定及活性檢測將純化復性的融合蛋白EGF-IL-18標記熒光染料Cy3,通過受體配體免疫熒光法檢測EGF-IL-18和腫瘤細胞表面EGFR結合。融合蛋白E

4、GF-IL-18與人白血病細胞(KG-1)共培養(yǎng)24 h,ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ的分泌水平來初步評價EGF-IL-18融合蛋白的復性效果和生物學活性；融合蛋白EGF-IL-18以系列梯度濃度作用于NK-92細胞,CCK-8試劑盒檢測NK-92細胞的增殖水平。
　　 結果:
　　 1.原核表達載體的構建和表達雙酶切分析、PCR鑒定以及測序結果表明原核表達載體pET12a(+)-EGF-IL-18同設計相符；工

5、程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET12a(+)-EGF-IL-18誘導表達后,在分子量為21kDa處可產(chǎn)生特異的表達條帶,并能夠被抗人IL-18單克隆抗體所識別,與預期一致；C12T、C21T、T24C、A543T、C549T、T552C、A558G突變有利于EGF-IL-18蛋白表達。
　　 2.EGF-IL-18高密度發(fā)酵條件優(yōu)化以及純化復性 EGF-IL-18融合蛋白在大腸桿菌中實現(xiàn)高效表達,確定高密度發(fā)酵

6、工藝優(yōu)化條件:pH為7.0,誘導溫度為30℃,誘導時機為OD600=1,補料開始時間為4h。各批次發(fā)酵中,最高獲得濕菌重69.9g/l,通過S-100分子篩和DEAE陰離子交換柱兩步法純化復性后每升發(fā)酵液最終獲得561mg純度大于90％的EGF-IL-18融合蛋白。
　　 3.EGF-IL-18蛋白表征鑒定及活性檢測激光共聚焦顯示EGF-IL-18和A431細胞表面的EGFR特異性結合:IFN-γ ELISA結果顯示,EGF-I