IL-24和EGF受體干擾序列融合基因的克隆、表達(dá)及活性研究.pdf

1、IL-24(白細(xì)胞介素24)具有抑制腫瘤血管生成活性、刺激免疫系統(tǒng)應(yīng)答和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式聯(lián)合發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞尤其是實(shí)體瘤細(xì)胞表面有大量EGFR(Epithelial Growth Factor Receptor，表皮生長(zhǎng)因子受體)的表達(dá)。表皮生長(zhǎng)因子肽段中的C環(huán)是EGFR特異性結(jié)合位點(diǎn)，稱(chēng)為EGF受體干擾序列(EGFRi，Epithelial Growth Factor Receptor interference)。

2、EGFRi能與表皮生長(zhǎng)因子特異性結(jié)合，但不具有刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，特異的腫瘤靶向性和IL-24獨(dú)特免疫學(xué)作用的有機(jī)結(jié)合為腫瘤的細(xì)胞因子治療提供了新的思路。本論文應(yīng)用重疊延伸PCR(Overlapping PCR)技術(shù)將IL-24與EGFRi連接，并研究了該融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)和對(duì)重組菌的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)對(duì)純化的融合蛋白進(jìn)行抑瘤活性研究。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1.IL-24的克隆及在大腸桿菌中表達(dá)

3、>　　 以含有切除了N端信號(hào)肽的IL-24成熟肽基因的質(zhì)粒PMAL-c2x-IL-24為模板，通過(guò)PCR技術(shù)獲得IL-24，構(gòu)建表達(dá)載體PET-22b-IL-24，將其電轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)期值(19 kD)一致。利用Ni2+親合層析柱純化誘導(dǎo)表達(dá)的的IL-24蛋白，MTT檢測(cè)結(jié)果證實(shí)其具有體外抑瘤活性，利用Ni2+親合層析柱純化誘導(dǎo)表達(dá)的的IL-24蛋白，MTT檢測(cè)結(jié)果證實(shí)

4、其具有體外抑瘤活性。
　　 2.融合基因EGFRi-IL-24的克隆及在大腸桿菌中表達(dá)
　　 以含有切除了N端信號(hào)肽的IL-24成熟肽基因的質(zhì)粒PET-22b-IL-24為模板，通過(guò)重疊延伸PCR(Overlapping PCR)技術(shù)獲得了融合基因EGFRi-IL-24，構(gòu)建克隆載體pUC-EGFRi-IL-24；構(gòu)建表達(dá)載體PET-22b-EGFRi-IL-24，將其電轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中，IPTG誘

5、導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)期值(22 kD)一致。
　　 3.融合蛋白的Ni2+親合層析柱純化
　　 利用Ni2+親合層析柱純化重組菌表達(dá)的融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，表達(dá)的融合蛋白純化后純度有了大幅度的提高，融合蛋白的純度超過(guò)了80％。
　　 4.融合蛋白體外抑瘤活性的研究
　　 以MTT法初步評(píng)價(jià)融合蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和肺癌細(xì)胞A549的抗腫瘤活性，經(jīng)相同濃度梯度的融合蛋白EGFRi