融合蛋白d-EGF的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、克隆、原核表達(dá)及鑒定.pdf

1、目的：對(duì)融合蛋白 d-EGF二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)并分析其活性部位的可能影響，進(jìn)行原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。
　　方法：以融合蛋白質(zhì)基因序列為基礎(chǔ)，用DNAStar軟件預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；用Insight II軟件對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模預(yù)測(cè)。在對(duì)融合蛋白理論預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建含β-defensin-3、EGF的重組質(zhì)粒，應(yīng)用重組PCR等方法，將EGF的基因序列融合到β-defensin-3 DNA序列的3’末端，將

2、融合基因克隆入原核表達(dá)載體pET-SUMO,構(gòu)建目的重組質(zhì)粒 pET-SUMO-d-EGF。采用 PCR、測(cè)序等方法對(duì)目的基因是否正確重組進(jìn)行鑒定；以重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21（DE3），以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過Ni-trap柱純化，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)初產(chǎn)物及純化產(chǎn)物。最后用Western-blot對(duì)其特異性進(jìn)行鑒定；用MTT法檢測(cè)其促細(xì)胞增殖活性；用紙片擴(kuò)散法藥物敏感試驗(yàn)、微量稀釋法檢測(cè)其抗菌活

3、性。
　　結(jié)果：采用DNAStar軟件的Gamier Robson方法預(yù)測(cè)的結(jié)果表明，融合蛋白質(zhì)d-EGF含較多的β折疊結(jié)構(gòu)；Charge Density-Charge法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)3-22、31-48區(qū)段帶豐富的正電荷；Insight II軟件分析顯示重組蛋白d-EGF中原蛋白β-defensin-3、EGF三級(jí)結(jié)構(gòu)中的活性必須的六個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵在融合蛋白中都能夠正確形成，維持β-defensin-3三級(jí)結(jié)構(gòu)的3個(gè)反向平行的β折疊片

4、結(jié)構(gòu)在融合蛋白中能夠形成。融合蛋白的結(jié)構(gòu)含有原蛋白β-defensin-3、EGF的生物活性結(jié)構(gòu)。成功構(gòu)建β-defensin-3、EGF重組質(zhì)粒，經(jīng)重組PCR成功擴(kuò)增出294bp的目的片段，重組體PCR結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，測(cè)序正確。轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的E.coli BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、SDS-PAGE分析得到28 kD左右的目的蛋白條帶。用Western-blot鑒定出融合蛋白含有EGF，β-防御素-3的相應(yīng)蛋白抗原表位。用

5、MTT法測(cè)得融合蛋白 d-EGF EC50約為0.4ng/ml,與EGF標(biāo)準(zhǔn)品EC500.08-0.8 ng/ml相符；用紙片擴(kuò)散法藥物敏感實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯抑菌環(huán)出現(xiàn)，抑菌濃度25μg/ml相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品 hβ-defensin-3的MIC12.5μg/ml，說明d-EGF抑菌活性比標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)弱一些。
　　結(jié)論：在預(yù)測(cè)融合蛋白 d-EGF的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-SUMO d-EGF,并表達(dá)出純