大鼠癌鈣調(diào)蛋白_OM基因克隆、原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、視覺神經(jīng)中成熟的神經(jīng)纖維和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（centralnervoussystem,CNS）的其他組成部分一樣，一旦受損將非常難以修復(fù)。成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinalganglioncell,RGC）經(jīng)歷了損傷或視神經(jīng)眶內(nèi)損傷而發(fā)生凋亡后，無法再生。因此，如何延緩RGC的變性，并重新激活軸突再生程序，使它們能夠幸存下來并在受損的視神經(jīng)中再生出長長的的軸突一直是眼科及CNS研究領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，眼內(nèi)活化的巨噬細(xì)胞對RG

2、C具有顯著的促進(jìn)軸突再生效應(yīng)。而其中，由活化的巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌的癌鈣調(diào)蛋白（oncomodulin,OM）是這一效應(yīng)的最重要的介導(dǎo)者。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在活體內(nèi)，OM對損傷的成熟視神經(jīng)及周圍感覺神經(jīng)元也有促進(jìn)軸突再生作用。而OM發(fā)揮再生促進(jìn)效應(yīng)的確切機(jī)制尚不清楚。目前，國內(nèi)外均尚未有報(bào)道。對于OM的結(jié)構(gòu)和神經(jīng)再生功能方面的研究，目前國內(nèi)尚無報(bào)道。因此,對其進(jìn)行相關(guān)研究,可為神經(jīng)再生新途徑的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR從

3、活化的大鼠巨噬細(xì)胞中獲得OM基因，構(gòu)建了pET22b(+)-OM原核表達(dá)載體并成功表達(dá)了OM，為進(jìn)一步完成對該蛋白的純化及對其活性研究與探討其促進(jìn)軸突再生的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1.對大鼠癌鈣調(diào)蛋白（OM）進(jìn)行基因克隆，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒并加以鑒定。
　　2.OM的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一：大鼠癌鈣調(diào)蛋白_OM基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　1.從SD大鼠腹腔中提取巨噬細(xì)

4、胞培養(yǎng)活化，經(jīng)巨噬細(xì)胞特異性抗體CD68鑒定；
　　2.從活化的巨噬細(xì)胞中提取總RNA,利用相應(yīng)引物，通過RT-PCR的方法獲得OM基因序列，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定；
　　3.通過中間載體PUC57進(jìn)行目的基因克隆，將陽性克隆質(zhì)粒酶切，與原核表達(dá)載體PET-22b(+)連接，構(gòu)建PET-22b(+)-OM原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)菌檢PCR、DNA測序鑒定。
　　實(shí)驗(yàn)二：大鼠癌鈣調(diào)蛋白_OM基因原核表達(dá)載體在大腸桿菌中的表達(dá)及鑒

5、定
　　PET-22b(+)-OM重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE觀察表達(dá)產(chǎn)物，Western-blot鑒定。
　　結(jié)果：
　　1.1％瓊脂糖凝膠電泳獲得目的基因OM，大小為346bp左右，與設(shè)計(jì)的預(yù)期目的基因大小一致；
　　2.回收目的基因OM與中間載體PUC-57連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，菌檢PCR獲得長度500bp左右的陽性克隆,與預(yù)期大小完全一致。抽提質(zhì)粒P

6、UC-57-OM,DNA測序鑒定證實(shí)與預(yù)期序列一致。
　　3.質(zhì)粒PUC-57-OM酶切后與載體PET-22b（+）連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，抽提質(zhì)粒PET-22b（+）-OM,經(jīng)酶切鑒定及DNA測序后證實(shí)與預(yù)期序列一致。
　　4.重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)-OM轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明目的蛋白OM主要以可溶形式存在于細(xì)菌裂解后的上清中，并經(jīng)過westernb